Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Вирусный наночастиц для doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

Завод вирусных наночастиц (VNPs) являются перспективными платформами для применений в биомедицине. Здесь мы описываем процедуры завод VNP распространение, очистка, характеристика и bioconjugation. Наконец, мы покажем применение VNPs опухоли самонаведения и визуализации с использованием модели мыши ксенотрансплантата и флуоресценции.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) Распространение

  1. Установите камеру закрытый завод контролирует до 15 часов в день (100% света, 25 ° C, влажность 65%) и 9 ч ночи (0% света, 22 ° С, 60% влажности).
  2. Инокулировать растений в соответствии с графиком в таблице 1.
CPMV PVX, ВТМ, и BMV
День 0: Plant 3 вигны семян / горшок. День 0: Завод ~ 30 Н. benthamiana семян / горшок. Удобрять раз в неделю с 1 столовую ложку удобрения / 5 л воды.
День 14: Re-пот Н. benthamiana на 1 растение / банк.
День 10: Infect оставляет первичные листья с CPMV (5 мкг/50 мкл / лист) механической инокуляции с помощью светового пыль карборунда. День 28: Infect трех до FIve листья с PVX, ВТМ, или BMV (5 мкг/50 мкл / лист) механической инокуляции с помощью светового пыль карборунда.
День 20: Harvest листья и хранят в -80 ° C. День 42: Harvest листья и хранят в -80 ° C.

Таблица 1. Сроки растет, заражение, и сбор урожая листьев.

Примечание: только распространение CPMV показана в качестве примера.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) очистки

Примечание: Все действия выполняются на льду или при температуре 4 ° C.

  1. Однородный 100 г замороженных листьев в стандартный блендер использованием 2-х томах холодного раствора (см. таблицу 2). Фильтр через 2-3 слоя марли.
  2. Для PVX, отрегулировать рН до 6,5 с помощью 1 M HCl. Добавить 0,2% (вес / объем) аскорбиновой кислоты и 0,2% (вес / объем) натрия sulfiТе.
  3. Центрифуга гомогената растительным сырьем при 5500 х г в течение 20 мин. Сбор супернатант.
  4. Для BMV, слой 25 мл супернатанта более 5 мл 10% (вес / объем) раствор сахарозы. Центрифуга при 9000 мкг в течение 3 ч и ресуспендируют гранул в 38,5% CsCl решение (вес / объем). Mix путем встряхивания в течение 5 часов, а затем продолжить с шага 2.12.
  5. Извлечение растительного материала путем добавления 0,7 объемов 1:1 (объем / объем) хлороформа :1-бутанола. Размешайте смесь в течение 30-60 мин.
  6. Центрифуга решение при 5500 х г в течение 20 мин. Соберите верхнюю водную фазу.
  7. Добавить NaCl до 0,2 М и 8% (вес / объем) ПЭГ (MW 8000). Для ВТМ, добавить 1% (V / V) Triton X-100. Движение по крайней мере, 1 час, то пусть сидят, по крайней мере, 1 час.
  8. Центрифуга решение при 15000 х г в течение 15 мин. Ресуспендируют гранул в 10 мл буфера. Для PVX, добавить 0,1% β-меркаптоэтанол и мочевины до 0,5 М.
  9. Центрифуга при 8000 мкг в течение 30 минут и собирают супернатант.
  10. Ультрацентрифуге супернатанта при 160000 х г в течение 3 часов. Ресуспендируют гранул в 5 мл буфера выводаvernight.
  11. Подготовить 10-40% сахарозы градиентом, используя равные объемы 10%, 20%, 30% и 40% сахарозы в буфере (тяжелый первый). Разрешить градиента, чтобы уравновесить ночь при комнатной температуре.
  12. Ультрацентрифуга суспендируют осадок на градиенте сахарозы при 100000 х г в течение 2 часов (24 ч для BMV).
  13. Сбор светлая полоса рассеяния и диализ против буфера.
  14. Охарактеризовать VNPs (см. ниже) и хранить при 4 ° C. Для длительного хранения, хранят при температуре -80 ° C.
CPMV и ВТМ 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0)
38,5 мм KH 2 PO 4
61,5 мм K 2 HPO 4
PVX 0,5 М бората буфером (рН 7,8)
0,5 М борной кислоты
Отрегулируйте рН с NaOH
BMV SAMA буфером (рН 4,5)
250 мМ ацетата натрия
10 мМ MgCl 2
2 мМ β-меркаптоэтанол (добавить свежие)

Таблица 2. Буферы и их рецепты для каждого VNP.

Примечание: только распространение CPMV показана в качестве примера.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) Характеристика

  1. Выполните УФ / видимой спектроскопии для определения концентрации VNPs.
    1. Измерить абсорбцию во 2 мкл образца с помощью NanoDrop спектрофотометр.
    2. Определить концентрацию частиц и красителей помощью Beer-Lambert закон (= εcl, где это поглощение, ε-коэффициент экстинкции, с-концентрация, и я это путь длиной). Длина пути составляет 0,1 см для NanoDrop.
      VNP конкретные коэффициенты экстинкции являются:
      CPMV: 8,1 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
      PVX: 2,97 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
      TMV: 3,0 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
      BMV: 5,15 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
  2. Анализ частиц по размерам и исключения быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC).
    1. Использование Superose 6 гель-колонки и Akta Explorer, нагрузка 50-100 мкг VNPs в 200 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0).
    2. Установка детекторов до 260 нм (нуклеиновые кислоты), 280 нм (белок), а длина волны возбуждения любого красителей прилагается.
    3. Запуск при скорости потока 0,5 мл / мин в течение 72 мин.
    4. Профиль элюции и A260: A280 нм указывает, является ли подготовка VNP чисто и ли частицы целы и собраны.
      Следующие A260: 280 отношения указывают чистого препарата VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Выполните денатурации (сборные NuPAGE) Bis-Tris полиакриламидном 4-12% градиентного гель-электрофореза для анализа чистоты подготовке и сопряжения отдельных белков пальто.
    1. Добавьте 3 мл буфера для образцов 4x LDS до 10 мкг частиц в 9 мкл буферного раствора фосфата калия. Добавить еще 1 мкл образца 4x LDS буфера и 3 мкл β-меркаптоэтанола к BMV сократить большое количество дисульфидных связей.
    2. Инкубируйте в нагревательный блок в течение 5 мин при температуре 100 ° C.
    3. Загрузка образцов на гель SDS.
    4. Выполнить образцы при 200 В в течение 1 часа в 1x MOPS работает буфер.
    5. Документ гель под воздействием ультрафиолетового излучения для визуализации флуоресцентных белков пальто.
    6. Для не-флуоресцентный белок, пятно Кумасси синего (0,25% (вес / объем) Кумасси Brilliant Blue R-250, 30% (об / об) метанола, 10% (V / V) уксусной кислоты) в течение 1 часа.
    7. Destain с 30% метанола, 10% уксусной кислоты в течение ночи. ChanGE решение, если требуется.
    8. Документ гель при дневном свете.
  4. Анализ целостности частиц методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
    1. Развести образцы 0.1-1 мг / мл в 20 мкл дистиллированной воды.
    2. Поместите 20 мкл капли образца на Parafilm.
    3. Крышка капель с сеткой ТЕА и пусть сидят в течение 2 мин. Вика излишки раствора на сетку с фильтровальной бумагой.
    4. Промойте сетку размещения на каплю воды DI, то влагу сухой.
    5. Пятно сетку, поставив на 20 мкл капли 2% (вес / объем) уранилацетата в течение 2 мин. Вика лишнее пятно с фильтровальной бумагой.
    6. Промойте сетку еще раз в воду.
    7. Соблюдайте сетку под просвечивающего электронного микроскопа.

4. Химическая Сопряжение VNPs с ПЭГ и флуорофоры, очистка и характеристика

  1. Для расчетов для реакций ниже, молярная масса VNPs являются:
    CPMV: 5,6х 10 6 г / моль
    PVX: 35 х 10 6 г / моль
    TMV: 41 х 10 6 г / моль
    BMV: 4,6 х 10 6 г / моль
  2. Сопряженные красителей и ПЭГ на поверхности лизинов из CPMV и ХВК, используя один шаг N-гидроксисукцинимид реакции сочетания: Добавить 2500 молярных эквивалентов (все молярной эксцессов относятся к молярным избытком в ВНП) от Alexa Fluor 647 сукцинимидил эфира и 4500 эквивалентами NHS- PEG (MW 5.000) растворяли в ДМСО в CPMV в 0,1 М фосфатного буфера калия. При работе с PVX, добавьте 10000 молярный избыток NHS-красителя и NHS-PEG. Отрегулируйте буфер и ДМСО объемы такие, что конечная концентрация CPMV и PVX составляет 2 мг / мл и ДМСО содержание составляет 10% от общего объема реакции. Выдержите в течение ночи реакционную смесь при комнатной температуре в защищенном от света месте. CPMV и PVX есть 300 и 1270 адресуемых лизина, соответственно. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения похимическая модификация CPMV и PVX: 13-15).
  3. Сопряженные красителей и PEG в тирозины ВТМ по диазония связи следует меди (I)-катализируемой азид-циклоприсоединения алкинов.
    1. Подготовка соли диазония (алкинов) путем смешивания 400 мкл 0,3 М р-толуолсульфокислоты, 25 мкл 3,0 М нитрита натрия и 75 мкл 0,68 млн. дистиллированной 3-ethynylaniline растворяют в ацетонитриле при 4 ° С в течение 1 часа.
    2. Добавить 3,3 мл боратного буфера, рН 8,8, содержащий 100 мМ NaCl в 1,25 мл ВТМ (20 мг / мл раствора).
    3. Реакция ВТМ с 450 мкл соли диазония (алкинов) раствор в ледяной бане в течение 3 часов, чтобы добавить алкином перевязки обращаться к ВТМ по диазония связи. Решение превратится в светло-коричневый цвет. TMV есть 2140 доступных тирозины для сопряжения.
    4. Очищают окончательного продукта с использованием сахарозы подушке, как описано в пункте 4.4.
    5. Прикрепить азид-функциональной Alexa Fluor 647 и ПЭГ-азид (MW 5.000) Усинг меди (I)-катализируемой азид-циклоприсоединения алкинов (CuAAC). Добавить 2 эквивалентов красителей и PEG-азид в белковую оболочку и инкубируют с 1 мМ CuSO 4, 2 мМ AMG, и 2 мМ аскорбата натрия при комнатной температуре в течение 15 мин. Отрегулируйте объем буфера так, чтобы конечная концентрация реакции ВТМ составляет 2 мг / мл. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения по химической модификации TMV: 16,17).
  4. Сопряженные красителей для лизина и цистеина PEG, чтобы из BMV цистеина мутант (cBMV):
    1. Добавить 2000 молярных эквивалентов Орегон Зеленый 488 сукцинимидил эфира растворяют в ДМСО в cBMV в 0,1 М TNKM буфера (50 мМ Трис-основания, 50 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, рН 7,4). Отрегулируйте буфер и ДМСО объемы такие, что конечной концентрации BMV составляет 1 мг / мл и ДМСО содержание составляет 10% от общего объема реакции. Инкубируйте реакционной смеси в течение ночи при 4 ° C в защищенном от света.
    2. Purify частицы с помощью центробежнойfugal фильтры, как описано в пункте 4.4.
    3. Добавить 2000 молярного избытка PEG-малеимида (MW 2.000) с использованием тех же условиях реакции, как до, так и инкубировать реакционной смеси в течение 2 ч при 4 ° C. cBMV имеет 180 реактивных лизина и цистеина. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения по химической модификации BMV: 18).
  5. Очистка: Передать раствор через 40% (вес / объем) сахарозы подушке на 160000 мкг в течение 2,5 часов. Повторно растворить осадок в буфер. Кроме того, диализ против соответствующего буфера, используя 10 кДа отсечки фильтров спина.
  6. Характеристика: ПЭГилированный и флуоресцентно-меченных VNPs анализируются с помощью описанных выше методов: УФ / видимой спектроскопии, SDS гель-электрофореза, FPLC, и TEM (не показан, однако, относятся к рис. 6 и 7).

5. Нацеливание на опухоль и визуализации с использованием модели мыши ксенотрансплантата

  1. Культура НТ-29 толстой кишки человека раковых клеток в среде RPMI с добавлением 5% FBS, 1% пенициллина, стрептомицина и 1% L-глутамина при 37 ° С в 5% СО 2 с использованием 175 см 2 колбы культуре клеток.
  2. Вымойте клетки дважды стерильной PBS и сбора урожая путем инкубации с 5 мл трипсина-EDTA при 37 ° C в течение 5 мин. Инактивации трипсина с 5 мл среды RPMI. Сбор клеток путем центрифугирования при 500 мкг в течение 5 мин. при 4 ° С и ресуспендируют в свежей RPMI на 5x10 6 cells/50 мкл среды (определить общее количество клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометр). Смешать с равным объемом матригель перед инъекцией (держать все решения и реагенты стерильные).
  3. Закупка шестинедельных NCR Nu / Nu мыши и сохранить их на люцерну диета на 2 недели. [Примечание:. Всех животных процедуры должны быть IACUC утвержденных] Вызвать ксенотрансплантатов опухоли путем подкожной инъекции 5x10 6 клеток/100 мкл / опухоли в бока (2 опухолей / мышь), используя 18 1/2 калибровочных стерильныхиглу. Следить за животным регулярно. Измерьте размер опухоли использованием суппортами и позволяют опухоли расти в среднем объеме 20 мм 3 (в течение 12 дней). Назначение мышей к двум различным группам случайным: PBS и ВНП (п = 3 животных / группы / момент времени). Использование 1 мл 28 Шприц инсулин датчика, управление внутривенно хвостовой вены для инъекций 100 мкл стерильной PBS или 10 мг / кг VNP формулировки.

Примечание: Культура ткани экспериментов и исследований с живыми животными не будет показано. Практическая демонстрация будет ограничено обработки тканей и сбора данных. Для ссылки на HT-29 модель ксенотрансплантатов опухоли, мы отсылаем читателя к работе 19.

Три методы используются для оценки опухоли самонаведения VNPs:

  1. Флуоресценция визуализации с использованием Maestro Imaging System: Жертва мышей в различные моменты времени (2, 24 и 72 часов) с использованием CO 2газа. Препарировать животных и акцизных все основные органы (мозг, сердце, легкие, селезенка, почки и печень), а также опухоли на флангах, разместить тканей на парафильмом и анализа с флуоресцентной инструмент визуализации с использованием желтого возбуждения и испускания фильтры (800 мс воздействия), чтобы обнаружить присутствие флуоресцентные сигналы в тканях (производное от A647 этикетке сопряженных с VNPs). Сохранить изображения и анализа интенсивности использования флуоресцентных ImageJ 1.44o программного обеспечения ( http://imagej.nih.gov/ij ). Сравните структуру поглощения VNPs в опухолях с другими крупными ткани со временем.
  2. После обработки изображений, разрезать каждую ткань пополам и одну половину вставлять в октябре соединение для крио-срезов и конфокальной анализа. Сбор другая половина в предварительно взвешенные крио-флаконов и сразу же заморозить их использованием жидкого N 2. Хранить при температуре от -80 ° C до готовности для дальнейшей обработки.
  3. Флуоресценция определения: ReШнур тканей веса. Оттепель замороженных тканей при комнатной температуре и поместите их в отдельную 50 мл пробирки Сокол, содержащий 1 мл PBS. Использование ручной гомогенизатор тканей, гомогенизации ткани в течение 2-3 мин в PBS затем передать гомогената в микроцентрифуге труб. Центрифуга гомогенатах в течение 10 мин при 13000 мкг для удаления не гомогенизированные ткани.
  4. Внесите 100 мкл супернатанта из тканей из каждой группы (PBS и VNP составы / моменты времени) в 384-луночные черные УФ пластины. Оценка интенсивности флуоресценции (Ex / Em длинами волн 600/665) с помощью планшетов. Нормализация полученных флуоресцентных значения по ткани весом.
  5. Иммуногистохимия: Подготовка крио-микротома разделах (10 мкм) и хранить при температуре -20 ° C. Пятно срезов тканей для клеточных ядер (DAPI) и эндотелиальные клетки маркером (FITC-меченных анти-CD31 антитела мыши). Провести конфокальной микроскопии анализа для сопоставления сосудистой и внутри опухолевой локализации флуоресцентно-меченных VNPс.

Примечание: Эта процедура не будет продемонстрировано, представитель данные приведены на рисунке 8. Для ссылки на иммуногистохимии и описаны методы окрашивания, мы отсылаем читателя к работе 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол обеспечивает подход к химической модификации VNPs и их приложения в естественных изображений опухоли. Животное флуоресценции, флуоресценции количественного и иммуногистохимических методов, представленные здесь, полезны для изучения и оценки биораспределения опухоли самонаведения. Эти методы дают ценную информацию в отношении доступа наночастиц в опухоли с помощью ЭПР-эффект. Объединив результаты различных аналитических методов, мы получаем мощный подход к оценке локализации и биораспределение VNPs.

До этих исследований могут быть выполнены, однако, важно, чтобы получить чистый препарат вируса. Наряду с механической прививки, возможна альтернатива для распространения ВНП является агроинфильтрации, которые могут иметь высокую преобразования и норма накопления. При размножении VNPs, следует позаботиться, чтобы сохранить растения заражены различными вирусами, как отдельный тO Во избежание перекрестного загрязнения. В частности, ВТМ легко распространяется и передается механически. Другим важным шагом будет помнить о осуществляющий очистку вируса на льду или при температуре 4 ° C. Все буферы должны быть использованы ледяной. Более низкая температура необходима, чтобы предотвратить любые повреждения VNPs в результате протеаз и окислительных ферментов, присутствующих в растительном материале.

Низкая урожайность очищенной VNPs могут возникнуть в результате нескольких факторов. Возможной причиной может быть возраст VNPs использовать для размножения. Желательно использовать последние препараты вируса. Например, C-клемма 24 аминокислот белка S пальто CPMV необходимые для подавления генов. Удаление этой поверхности, подвергшихся воздействию регионе происходит с течением времени за счет протеолиза. Хотя структура и стабильность CPMV не влияет, замедление роста и задержка распространения вируса результаты. Другим источником низкой урожайности является потеря VNPs во время очистки. Частности, намание должно быть уделено ресуспендирования шаг после PEG осадков. Неполное ресуспендирования осадка может привести к VNP потеряли в осадок последующей стадии центрифугирования.

В целом, bioconjugation химии, представленные здесь проста. 14,17,18,21 характеристику методам, описанным являются ценными для обеспечения целостности частиц и определения степени сопряжения. Молярная эксцессы могут быть скорректированы в зависимости от применения и степени функционализации лучшего.

При работе с моделью ксенотрансплантата мыши, наиболее существенным практике после асептики. Кроме того, инъекции хвостовую вену является важным шагом для обеспечения равномерной дозы образца для каждой мыши. Это может помочь разместить хвост в теплую воду заранее, чтобы расширяются вены. Другим аспектом является автофлуоресценции для флуоресцентной микроскопии и измерений. Вообще, ткани автофлуоресценции является минимизацияред выше 600 нм, что делает длинный красителей длины волны излучения с максимумами за 600 нм оптимальным, так как изображение зонда. Тем не менее, нормальная диета мышей состоят из хлорофилла, содержащие люцерну, которая также флуоресцирует красным. В результате, это необходимо для поддержания мышей на диету без люцерны в течение по крайней мере 2 недели, чтобы уменьшить фоновый сигнал. Наконец, следует отметить, что использование флуоресцентной детекции флуоресценции ограничено в связи с различиями в рассеяние и поглощение среды в различных тканях. Следовательно, визуализация используется для визуализации и в качестве первоначального метода контроля биораспределения, в то время как количественное осуществляется с помощью гомогенатах тканей.

Некоторые преимущества использования VNPs в качестве технологической платформы являются их монодисперсности, биосовместимость, способность к расширению масштабов производства, и ответственность на нескольких стратегий функционализации. В дополнение к химической технологии, генная инженерия показано здесь, с введениемния цистеина в BMV в качестве мишени для bioconjugation. Генная инженерия может также быть использована для введения таргетинга пептиды или близость теги. Хотя протокол, описанный использует двойной маркировкой (краситель и PEG) частицы, текущие исследования смотрят на включение дополнительных функций (например, терапии и ориентации) для повышения специфичности ткани и терапевтической эффективности. Таким образом, этот подход закладывает основу для будущих биомедицинских приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH / NIBIB грантов R00 EB009105 (для NFS) и P30 EB011317 (для NFS), NIH / NIBIB обучение грант T32 EB007509 (для AMW), Case Western Reserve University Междисциплинарный Alliance Investment Грант (для NFS), и дело Всесторонний Онкологический центр грант P30 CA043703 (для NFS). Мы благодарим Steinmetz Лаборатории бакалавриата студент исследователей для их практической поддержки: Надя Аят, Кевин Чен, Sourav (Sid) Dey, Элис Янг, Сэм Александр, Craig D'Cruz, Стивен Херн, Лорен Рэндольф, Брайан Таким образом, и Павел Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Вирусный наночастиц для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображения опухоли
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter