Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Viral Nanopartiküller doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Abstract

Nanomalzemelerin kullanımı malzeme bilimi ve tıp devrim potansiyeline sahiptir. Şu anda değişik nanopartiküller bir dizi görüntüleme ve tedavi uygulamaları için araştırılmaktadır. Bitkilerden elde edilen viral nanopartikül (VNPs) belirlenmiş boyutlarda ve şekillerde ile kendini monte bionanomaterials olarak kabul edilebilir. Steinmetz laboratuarda inceleme altına Bitki virüsleri çapı 30 nm her ikisi de Börülce mozaik virüsü (CPMV) ve Brom mozaik virüsü (BMV) oluşan icosahedral parçacıkları içerir. Biz de şu bitki virüsleri türetilen çubuk şeklinde ve ipliksi yapılar geliştiriyoruz: 18 nm 300 nm boyutlarında ve ipliksi parçacıklar 515 oluştururlar Patates X virüsü (PVX), rijit çubuklar oluşturur Tütün mozaik virüsü (TMV), uzunluk ve genişlik olarak 13 nm olarak nm (okuyucu Refs ifade edilir. VNPs hakkında daha fazla bilgi için 1 ve 2).

planta büyük ölçekte kolaylıkla üretilebilir, son derece istikrarlı ve biyouyumlu vardır. Ayrıca, VNPs özellikle genetik modifikasyon veya kimyasal bioconjugation yöntemleri 3 kullanılarak tasarlanmış olabilir "programlanabilir" birimlerdir. VNPs yapısı atomik çözüm bulunmakta olduğu bilinmektedir, ve modifikasyonlar atomik seviyede 4, mevcut teknoloji teknolojileri ile sentetik nano kullanılarak elde edilemeyen bir kontrol seviyesinde uzaysal hassasiyet ile gerçekleştirilebilir.

Bu yazıda CPMV, PVX, TMV ve Vigna ungiuculata ve Nicotiana benthamiana bitkilerde BMV yayılımı tanımlar. Her VNP için Ekstraksiyon ve saflaştırma protokolleri verilmektedir. Saflaştırılmış ve kimyasal-etiketli VNPs karakterizasyonu için yöntemler tarif edilmiştir. Bu çalışmada, ch odaklanmakemical florofor ile VNPs etiketlenmesi (örneğin Alexa Fluor 647) ve polietilen glikol (PEG). Boyalar izleme ve 5-10 VNPs tespiti kolaylaştırmak ve onların farmakokinetiği 8,11 artırırken PEG protein nanopartiküller immünojenite azaltır. Biz bir fare ksenogreft tümör modeli kullanılarak Pegile VNPs yuvalandırma tümör ortaya. Maestro Görüntüleme Sistemi kullanılarak dokuların ex vivo floresan görüntüleme, homojenize dokularda floresans ölçme ve konfokal mikroskopi kombinasyonu biyodağılımını incelemek için kullanılır. VNPs retiküloendotelyal sistem (RES) ile temizlenir; homing tümör geliştirilmiş geçirgenlik ve saklama (EPR) etkisi 12 ile pasif olarak elde edilir. VNP nanoteknoloji güçlü bir plug-and-play görüntü teknolojisi ve in vivo hastalık siteleri tedavi. Bu daha fazla ilaç için yük ve klinik olarak-ilgili görüntüleme kısımları gibi doku-spesifik ligandlar taşımak için VNPs geliştirmektedirkanser ve kardiyovasküler hastalık aşırı eksprese moleküler reseptörleri hedef.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Yayılım

  1. Kapalı bitki odasının günün 15 saat (% 100 ışık, 25 ° C,% 65 nem) ve gece 9 saat (% 0 ışık, 22 ° C,% 60 nem) kontrollerini ayarlayın.
  2. Tablo 1'de çizelgesine göre bitki inoküle edin.
CPMV PVX, TMV ve BMV
Gün 0: Bitki 3 börülce tohum / saksı. Gün 0: Bitki ~ 30 N. benthamiana tohum / saksı. 1 çorba kaşığı gübre / 5 L su ile haftada bir kez gübreleyin.
Gün 14: 1 Bitki / pot Re-pot N. benthamiana.
Gün 10: Infect korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon tarafından CPMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile primer yapraklar bırakır. Gün 28: Infect üç five korindon tozunu bir ışık kullanarak mekanik inokulasyon yoluyla PVX, TMV veya BMV (5 μg/50 ul / yaprak) ile bırakır.
Gün 20: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C. Gün 42: Hasat yaprak ve -80 mağaza ° C.

, Büyüyen bulaşmasını ve yaprakları hasat için Tablo 1. Timeline.

Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, ve TMV) saflaştırılması

Not: Tüm adımlar buz üzerinde veya 4 yürütülmektedir ° C

  1. Soğuk tampon 2 cilt (bkz. Tablo 2) kullanılarak standart bir blender dondurulmuş yaprakları 100 g homojenize. Tülbent 2-3 katmanları süzülür.
  2. PVX için, 1 M HCl ile pH 6.5 'e ayarlayın. % 0.2 (w / v) askorbik asit ve% 0.2 (w / v) sodyum sulfi eklemete.
  3. 20 dakika boyunca 5.500 xg'de ham bitki Homojenat santrifüjleyin. Süpernatant toplayın.
  4. BMV için, tabaka% 10 (w / v) sakaroz çözeltisi, 5 ml süpernatant üzerine, 25 ml. % 38.5 CsCl çözeltisi (w / v) içinde 3 saat ve pelet tekrar süspansiyon 9,000 x g'de santrifüjleyin. 5 saat sallayarak karıştırın, ardından adım 2.12 ile devam edin.
  5. 1:1 (v / v) kloroform :1-bütanol 0.7 hacim ekleme yoluyla bitki materyali ayıklamak. 30-60 dakika boyunca karışımı karıştırın.
  6. 20 dakika boyunca 5,500 x g çözelti santrifüjleyin. Üst sulu faz toplanır.
  7. M 0.2 ve% 8 (ağırlık / hacim) PEG (MW 8000) ile NaCl ekleyin. TMV için, aynı zamanda (v / v) Triton X-100,% 1 ekleyin. En az 1 saat süre ile karıştırınız, sonra en az 1 saat boyunca bekletilir.
  8. 15 dakika boyunca 15.000 xg'de çözümü santrifüjleyin. 10 ml tampon içinde yeniden süspanse pelet. PVX için, 0.5 M için% 0.1 β-merkaptoetanol ve üre ekleyin
  9. 30 dakika boyunca 8.000 xg'de santrifüjleyin ve süpernatant toplamak.
  10. 3 saat boyunca 160,000 x g süpernatant Ultrasantrifüj. 5 ml tampon o da süspanse peletvernight.
  11. Eşit hacimde% 10,% 20,% 30, ve tampon içinde% 40 sakaroz (ağır ilk) ile bir% 10-40 oranında sakaroz eğim hazırlayın. Gradyan oda sıcaklığında gece boyunca dengelenmeye bırakın.
  12. Ultrasantrifüj 2 saat (BMV için 24 saat) için 100.000 xg'de sukroz gradient üzerinde pelet yeniden süspanse.
  13. Işık saçılması bandı toplayın ve tampon karşı dialyze.
  14. 4'te VNPs (aşağıda) ve mağaza Karakterize ° C. Uzun süreli depolama için, -80 ° C'de saklayın
CPMV ve TMV 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0)
38.5 mM KH 2 PO 4
61.5 mM K 2 HPO 4
PVX 0.5 M borat tamponu (pH 7.8)
0.5 M borik asit
NaOH ile pH ayarlama
BMV SAMA tamponu (pH 4.5)
250 mM sodyum asetat
10 mM MgCl2
2 mM β-merkaptoetanol (taze ekleyin)

Tablo 2. Her VNP için Tamponlar ve kendi tarifleri.

Not: Sadece CPMV yayma, örnek olarak gösterilmiştir.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX ve TMV) Karakterizasyonu

  1. VNPs konsantrasyonunu belirlemek için UV / Görünür Bölge spektroskopisi gerçekleştirin.
    1. Bir Nanodrop spektrofotometre kullanılarak numunenin 2 ul absorbansı ölçülür.
    2. Beer-Lambert yasası kullanılarak partikül ve boyaların konsantrasyonu belirleyin (A absorbans A = εcl, ε sönüm katsayısı, c konsantrasyon ve l yol uzunluğu). Yol uzunluğu Nanodrop için 0,1 cm dir.
      VNP özgü nesli katsayıları şunlardır:
      CPMV: 8.1 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
      PVX: 2.97 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
      TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
      BMV: 5.15 cm -1 mg -1 ml (260 nm)
  2. Boyut dışlama hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) parçacıkları analiz edin.
    1. Bir Superpoze 6 boyut dışlama kolon ve AKTA Explorer, 0.1 M potasyum fosfat tamponu (pH 7.0) ve 200 ul içinde VNPs yük 50-100 ug kullanılması.
    2. 260 nm (nükleik asit), 280 nm (protein) ve bağlı herhangi boyaların uyarma dalga boyu dedektörü olarak ayarlayın.
    3. 72 dakika boyunca 0.5 ml / dak 'lık bir akış hızında çalışırlar.
    4. Elüsyon profili ve A260: A280 nm VNP hazırlık saf olup olmadığını ve parçacıklar sağlam ve monte olup olmadığını gösterir.
      Aşağıdaki A260: 280 oranlarında saf VNP hazırlık göstermektedir:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1.7 ± 0.1
  3. Bireysel kat proteinlere hazırlanması ve konjugasyon saflığını analiz (prekast NuPAGE) Bis-Tris poliakrilamid 4-12% gradyan jel elektroforezi denatüre gerçekleştirin.
    1. Potasyum fosfat tampon 9 ul içinde 10 ug parçacıkların için 4x LDS numune tamponu 3 ml ilave edilir. Disülfid bağlarının yüksek sayısını azaltmak için BMV 4x LDS örnek tampon ve β-merkaptoetanol 3 ul ilave 1 ul ekleyin.
    2. 100, 5 dakika süreyle ısıtma bloğu içinde inkübe ° C.
    3. SDS jel üzerine örnekler yükleyin.
    4. Tampon çalıştıran 1x MOPS 1 saat için 200 V örnekleri çalıştırın.
    5. Floresan ceket proteinleri görselleştirmek için UV ışık altında jel belgeleyin.
    6. Floresan olmayan protein için, 1 saat için Coomassie mavisi (% 0.25 (w / v) Coomassie Brillant Blue R-250,% 30 (v / v) metanol,% 10 (v / v) asetik asit) ile leke.
    7. Gece boyunca% 30 metanol,% 10 asetik asit ile Destain. Change çözüm isteniyorsa.
    8. Beyaz ışık altında jel belgeleyin.
  4. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından parçacıkların bütünlüğünü analiz.
    1. 0.1-1 mg / DI su 20 ul ml numune sulandırınız.
    2. Parafilm ile ilgili örnekler 20 ul damla yerleştirin.
    3. TEM ızgara ile damla örtün ve 2 dakika bekletin. Filtre kağıdı ile ızgara üzerinde aşırı Solüsyon Wick.
    4. Kuru esneklik ardından DI bir damla su üzerine koyarak ızgara yıkayın.
    5. % 2'lik bir 20 ul damla (w / v) 2 dk için uranil asetat ile ilgili yerleştirilmesi ile ızgara Leke. Filtre kağıdı ile leke aşırı kapalı Wick.
    6. Suda bir kez daha ızgara yıkayın.
    7. Bir transmisyon elektron mikroskobu altında ızgara gözlemleyin.

4. PEG ve fluorophores, Saflaştırılması, ve karakterizasyonu ile VNPs Kimyasal Konjugasyon

  1. Aşağıdaki reaksiyonlar için hesaplamalar için, VNPs molar kütlesi vardır:
    CPMV: 5.6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4.6 x 10 6 g / mol
  2. Tek adımlı bir N-hidroksi süksinimit bağlama reaksiyonu kullanılarak CPMV ve PVX yüzey lysines ile boyalar ve PEG konjugatı: Alexa Fluor 647 süksinimidil ester ve 4.500, 2.500 eşdeğer molar eşdeğerleri (tüm molar aşırı VNP göre molar fazlalıkta bakınız) ekleyin NHS PEG (MW 5,000) 0.1 M potasyum fosfat tamponu içinde CPMV için DMSO içinde çözülür. PVX çalışırken, NHS-boya ve NHS-PEG 10.000 molar aşırı ekleyin. CPMV ve PVX nihai konsantrasyon 2 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı gece boyunca inkübe edin. CPMV ve PVX, sırasıyla, 300 ve 1,270 adreslenebilir lysines sahiptir. (Okuyucu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denirCPMV ve PVX kimyasal modifikasyonu: 13-15).
  3. Diazonyum kaplin ile TMV tirozinlerin konjugat boyalar ve PEG bakır (I) katalizli azit-alkin siklo izledi.
    1. 0.3 M p-tolüensülfonik asit monohidrat, 3.0 M sodyum nitritin 25 ul, ve 0.68 M damıtık, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, asetonitril içerisinde çözündürüldü 3-ethynylaniline için 75 ul 400 ul karıştırılarak diazonyum tuzu (alkin) hazırlayın.
    2. TMV 1.25 ml (20 mg / ml stok çözeltisi) için NaCl 100 mM borat tamponu, pH 8.8, 3.3 ml ilave edilir.
    3. Bir alkin ligasyon diazonyum bağlanması ile TMV işlemek için eklemek için 3 saat boyunca bir buz banyosu içinde diazonyum tuzu (alkin) çözeltisi 450 ul TMV React. Çözüm açık kahverengi bir renk dönüşecektir. TMV konjugasyon için 2.140 kullanılabilir tirozinlerin vardır.
    4. Adım 4.4 'de tarif edildiği gibi bir sükroz tampon kullanarak nihai ürün üzerine koyulmuştur.
    5. Azid fonksiyonlu Alexa Fluor 647 ve PEG-azid (MW 5000) istimal takıng bakır (I) katalizli azit-alkin siklo (CuAAC). 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında 2 mM sodyum askorbat ile kılıf proteini ve inkübe başına boya ve PEG-azit 2 eşdeğer ekleyin. TMV nihai konsantrasyon tepki 2 mg / ml 'dir ki bu tür tampon hacim ayarlama. (: 16,17 okuyucu TMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir).
  4. Lysines ve BMV sistein mutant (cBMV) ve sistein ile PEG boyalar Dualı:
    1. 0.1 M TNKM tampon maddesi (50 mM Tris baz, 50 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, pH 7.4) içinde cBMV için DMSO içinde çözülür Oregon Green 488 süksinimidil ester, 2.000 molar eşdeğer ekleyin. BMV nihai konsantrasyon 1 mg / ml DMSO ve içeriği toplam reaksiyon hacmi% 10 olacağı şekilde DMSO ve tampon hacim ayarlayın. 4. gece boyunca reaksiyon karışımı inkübe ° C'de ışıktan korunur.
    2. Santrifüje kullanarak Purify parçacıklarolarak fugal filtreleri adım 4.4 'de tanımlanmıştır.
    3. Daha önce olduğu gibi aynı reaksiyon koşulları kullanılarak, PEG-maleimit (MW 2,000), 2.000 molar fazlası ilave edin ve 4 de 2 saat boyunca, reaksiyon karışımı inkübe ° C cBMV 180 reaktif lysines ve sistein sahiptir. (: 18 okuyucu BMV kimyasal modifikasyonu üzerine daha ileri okumalar için aşağıdaki referanslar denir).
  5. Saflaştırma: 2.5 saat boyunca 160,000 x g bir% 40 (w / v) sakaroz yastığı çözelti geçirir. Tampon pelet yeniden çözülür. Alternatif olarak, 10 kDa kesme spin-off filtreleri kullanarak uygun tampon karşı dialyze.
  6. Karakterizasyon: Pegile ve floresan-etiketli VNPs yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak analiz edilmiştir: görünür / UV spektroskopi, SDS jel elektroforezi, FPLC ve TEM (gösterilmemiştir, ancak, Şekil 6 ve 7'ye bakın).

5. Bir Fare Xenograftlarında Modeli kullanılarak Tümör Hedefleme ve Görüntüleme

  1. Kültür HT-29 RPMI medyumu içinde insan kolon kanser hücreleri 175 cm2 hücre kültür şişeleri ile% 5 CO2 içinde% 5 FBS, 37% 1 penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin ° C ile desteklenmiştir.
  2. 5 dk için 37 ° C 'de tripsin-EDTA 5 ml steril PBS ile inkübe ederek ve hasat ile iki kere yıkayın hücrelerini. RPMI ortam 5 ml tripsin inaktive eder. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj hücreleri toplayın. 4 at 5x10 6 cells/50 ul orta (tripan mavi ve bir hemasitometre kullanarak toplam hücre sayısını belirlemek) taze RPMI ° C ve tekrar süspansiyon. Enjeksiyonu (tüm çözeltiler ve reaktifler steril tutmak) öncesinde Matrigel eşit hacmi ile karıştırın.
  3. Procure altı hafta eski NCR nu / nu farelerine ve 2 hafta boyunca bir yonca ücretsiz diyet onları korumak. [Not:. Bütün hayvan prosedürleri IACUC onaylanmış olmalıdır] subkutan enjeksiyon yoluyla tümör xenografts øndükle 5x10 6 cells/100 steril bir 18 1/2 ölçü kullanarak yamaçlarında ul / tümör (2 tümörler / fare)iğne. Düzenli hayvanları izleyin. Pergel ile ölçülür ve tümör boyutu tümör 20 mm 3 (bir sonraki 12 gün içinde) bir ortalama hacim büyümesine izin verir. PBS ve VNP (n = 3 hayvan / grup / zaman noktası): rastgele iki farklı grup fareler atayın. Bir 1 ml 28 gauge insülin şırıngası kullanılarak, damar içi steril PBS kuyruk damarından enjeksiyon 100 ul ya da 10 mg / kg VNP formülasyon tarafından idare.

Not: Canlı hayvanlar ile Doku kültürü deneyleri ve çalışmalar göstermiştir olmayacaktır. Hands-on gösteri doku işleme ve veri toplama ile sınırlı olacaktır. HT-29 tümör ksenogreft modelinde bir referans için, okuyucunun ref adlandırılır. 19

Üç teknikleri VNPs yuvalandırma tümörü değerlendirmek için kullanılır:

  1. CO 2 kullanarak farklı zaman noktalarında (2, 24 ve 72 saat) de Kurban fareler: Maestro Görüntüleme Sistemi kullanarak Floresans görüntülemegaz. Kanatlarda tümörleri ile birlikte hayvan ve tüketim tüm önemli organları (beyin, kalp, akciğer, dalak, böbrek ve karaciğer) teşrih, parafilm üzerindeki dokular yerleştirin ve (800 ms sarı eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanarak floresan görüntüleme cihazı ile analiz dokularda floresan sinyalleri (VNPs konjuge A647 etiket türetilen) varlığını tespit maruz kalma). Görüntüleri kaydedin ve ImageJ 1.44o yazılımını kullanarak (floresan yoğunlukları analiz http://imagej.nih.gov/ij ). Süre ile diğer dokularda önemli olan tümörlerde VNPs alımını paterni karşılaştırın.
  2. Görüntüleme sonra yarıda her doku kesilmiş ve kriyo-kesit ve konfokal analizi için Ekim bileşik bir buçuk gömün. Önceden tartılmış kriyo-flakonlarda diğer yarısı toplayın ve bunları hemen sıvı N 2 kullanarak dondurma. Mağaza -80 ° C daha fazla işlem için hazır olana kadar.
  3. Floresans ölçümü: Rekord dokuları ağırlıkları. Oda sıcaklığında dondurulmuş doku çözülme ve PBS 1 ml içeren ayrı 50 ml Falcon tüpleri yerleştirin. Bir el dokusu homojenizatör kullanarak, PBS içinde 2-3 dakika süreyle doku homojenize sonra mikrofuge'de tüplere homojenat aktarın. Non-homojenize doku kaldırmak için 13.000 g'de 10 dakika süreyle homojenatlarında santrifüjleyin.
  4. 384 de siyah UV plaka içine her grup (PBS ve VNP formülasyonları / zaman puan) dokulardan süpernatant pipetleyin 100 ul. Bir plaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğu (Ex / Em dalga boylarında 600/665) değerlendirin. Doku ağırlıkları ile elde edilen floresan değerlerini normalleştirmek.
  5. İmmünohistokimya: -20 ° C'de kriyo-mikrotom bölümleri (10 mikron) ve mağaza hazırlayın Hücre çekirdeğinin (DAPI) ve endotel hücre işaretleyici (CD31 antikoru anti-fare FITC-etiketli) için doku kesitleri Leke. Floresan-etiketli VNP ve vasküler ve intra-tümöral yerelleştirme haritasına konfokal mikroskopi analizi yapıns.

Not: Bu işlem ortaya olmayacak, temsilci veriler Şekil 8 'de gösterilmiştir. Immünohistokimya ve anlatılan boyama yöntemleri ile ilgili bir başvuru için okuyucu ref adlandırılır. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol vivo tümör görüntüleme için VNPs ve uygulamaları kimyasal modifikasyonu için bir yaklaşım sağlar. Burada sunulan hayvan floresan görüntüleme, floresans ölçme ve immunohistokimyasal teknikler biyodağılımını okuyan ve tümör homing değerlendirmek için yararlıdır. Bu teknikler EPR etkisi ile tümörün nanopartiküller erişim konusunda değerli bilgiler sağlamaktadır. Çeşitli analitik yöntemlerle elde edilen sonuçları birleştirerek, VNPs lokalizasyonu ve biyodağılımını değerlendirmek için güçlü bir yaklaşım olsun.

Bu çalışmalar ancak yapılabilir önce, saf bir virüs hazırlığının sağlanması esastır. Apart mekanik inokulasyon gelen, VNP yayılması için olası bir alternatif yüksek dönüşüm ve birikim hızına sahip olabilir agroinfiltration vardır. VNPs propagandasını yaparken, bakımı ayrı t gibi farklı virüsler ile enfekte bitkiler tutmak için alınması gerekençapraz bulaşmayı önlemek o. Özellikle, TMV kolayca yayılmış ve mekanik olarak iletilir. Dikkatli olmak başka kritik adım buz üzerinde veya 4 ° C'de virüs arındırma yürütüyor Bütün buz gibi soğuk tampon kullanılır. Düşük sıcaklık proteazlar ve bitki malzemesi içinde mevcut oksitleyici enzim bir sonucu olarak VNPs hasar görmesini önlemek için gereklidir.

Saflaştırılmış VNPs Düşük verimleri birçok faktöre doğabilmektedir. Bunun nedeni yayılması için kullanılan VNPs yaşına olabilir. Bu, daha yeni virüs preparatları kullanmak için tercih edilir. Örneğin, CPMV ve G kat proteininin C-terminal 24 amino asitleri gen susturma ve bastırılması için gereklidir. Bu yüzeyin maruz kalan bölgenin Silme proteoliz nedeniyle zamanla oluşur. CPMV yapısı ve kararlılık etkilenmiş olmamakla birlikte, büyüme gerili ve geciktirilmiş virüs sonuç yayıldı. Düşük verimler diğer bir kaynağı saflaştırma sırasında VNPs kaybıdır. De özeltention PEG çökeltme sonra yeniden süspanse edilmesi adımına verilmelidir. Pelet yeniden süspanse Incomplete sonraki adım santrifüj pelet içinde kayıp VNP neden olur.

Genel olarak, burada sunulan bioconjugation kimyaları açıktır. Açıklanan 14,17,18,21 karakterizasyon yöntemleri partikül bütünlüğünün sağlanması ve konjugasyon kapsamını belirlemek için değerlidir. Molar aşırılıkların göre uygulama ve arzu edilen işlevsellik derecesine bağlı olarak ayarlanabilir.

Fare ksenogreft modeli ile çalışırken, en önemli uygulama aseptik teknik takip ediyor. Buna ek olarak, kuyruk damarından enjeksiyon her bir fare için üniform bir örnek doz sağlamak için özel bir öneme sahiptirler. Bu önceden damar genişletmek için ılık suda kuyruk yerleştirmek için yardımcı olabilir. Diğer bir önemli husus floresan görüntüleme ve ölçümler için otofloresans olduğunu. Genel olarak, doku otofloresans minimiz olduğugörüntüleme probu olarak optimum 600 nm ötesinde emisyon maxima ile uzun dalga boya yapma 600 nm, ötesinde ed. Ancak, normal fare diyetler de kırmızı fluoresces klorofil içeren yonca, oluşur. Bunun sonucu olarak, arka plan sinyallerini azaltmak için en az 2 hafta için bir yonca diyet üzerinde fareler korumak için gereklidir. Son olarak, floresan görüntüleme kullanılarak flüoresan tespiti sayesinde, çeşitli dokuların saçılma ve emme ortamlarda farklılıklar ile sınırlı olduğunu belirtmek gerekir. Kantitasyonu doku homojenatları kullanılarak yapılır iken Sonuç olarak, görüntüleme, izleme ve görüntüleme için biyodağılımını için bir yöntem, ilk olarak kullanılmaktadır.

Teknoloji platformu VNPs kullanmanın bazı avantajları kendi monodispersity, biyouyumluluk, ölçek-up üretimi için yeteneği ve çoklu işlevsellik stratejileri amenability vardır. Kimya mühendisliğinde ilave olarak, genetik mühendisliği ile introduc burada açıklanmaktadırbioconjugation için bir hedef olarak BMV için sissteinler sorusunu gündeme getirir. Genetik mühendisliği, aynı zamanda peptid veya afinite etiketleri hedefleme getirmek için kullanılabilir. Tanımlanan protokol (boya ve PEG) parçacıklar çift etiketli kullanır iken, devam eden çalışmaları doku özgüllüğü ve terapötik etkinliğinin artırmak için ek işlevler (yani, tedavi ve hedefleme) birleştiren bakıyoruz. Dolayısıyla, bu yaklaşım gelecekte biyomedikal uygulamalar için zemin bırakır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH / NIBIB hibe R00 EB009105 (NFS) ve P30 EB011317 (NFS), bir NIH / NIBIB eğitim bursu T32 EB007509 (AMW için), bir Case Western Reserve Üniversitesi Disiplinlerarası Birlik Yatırım Hibe (NFS), tarafından desteklenen ve Bir Olgu Kapsamlı Kanser Merkezi'nde hibe P30 CA043703 (NFS). Biz onların için Steinmetz Lab lisans öğrencisi araştırmacıların teşekkür hands-on desteği: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Yani, ve Paul Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter