Summary
Vi visar att en utvecklad biomedicinsk anordning innefattar kontinuerlig eller pulsad synlig laser baserad behandling som kombineras med antibiotikabehandling (gentamicin), resulterar i en statistiskt signifikant synergistisk effekt som leder till en minskning av lönsamheten för
Abstract
Nyligen fanns det flera publikationer om den baktericida effekten av synligt ljus, de flesta av dem att hävda att blå delen av spektrat (400 nm-500 nm) är ansvariga för att döda olika patogener 1-5. Den fototoxiska effekten av blått ljus har föreslagits vara ett resultat av Ijusinducerade reaktiva syreradikaler (ROS) bildning av endogena bakteriella fotokänslighetsförlänande som oftast absorberar ljus i det blå området 4,6,7. Det finns också rapporter om biocid effekt av röda och nära infraröda 8 samt grönt ljus 9.
I föreliggande studie har vi utvecklat en metod som tillät oss att karaktärisera effekten av hög effekt grön (våglängd 532 nm) kontinuerlig (CW) och pulsade Q-switchad (QS) ljus på Pseudomonas aeruginosa. Med denna metod vi har också studerat effekten av grönt ljus kombinerat med antibiotikabehandling (gentamicin) på bakterierna livskraft. P. aeruginosa är acEMENSAM noscomial opportunistisk patogen som orsakar olika sjukdomar. Stammen är ganska resistent mot olika antibiotika och innehåller många förutspådde AcrB / Mex-typ RND multidrug efflux system 10.
Metoden utnyttjade fritt levande stationär fas gramnegativa bakterier (P. aeruginosa stam PAO1), som odlas i Luria-buljong (LB)-medium utsätts för Q-switchad och / eller CW-lasrar med och utan tillsats av antibiotikumet gentamycin. Cellviabilitet bestämdes vid olika tidpunkter. De erhållna resultaten visade att laser-behandling enbart inte minskade cellviabiliteten jämfört med obehandlad kontroll och att gentamycin behandling ensam endast resulterade i en 0,5 log minskning av viabla celler för P. aeruginosa. Den kombinerade laser och gentamycin behandling, resulterade emellertid i en synergistisk effekt och lönsamhet P. aeruginosa reducerades med 8 stockens.
Den föreslagna metoden kan vidare vara genomföteras genom utveckling av katetern liknande anordning som kan injicera en antibiotisk lösning i infekterade organet samtidigt belysa området med ljus.
Protocol
Ett. Bakteriell kultur
- Gram-negativa P. aeruginosa-stam PAO1 odlades i Luria-buljong (LB) vid 37 ° C under 18 timmar.
- Odlingen av celler centrifugerades sedan vid 7500 rpm (varv per minut) under 5 minuter och supernatanten avlägsnades.
- Bakterierna återsuspenderades i 10% LB och åter odlas för ytterligare 2 h för att låta kulturen inträda stationär fas.
- Bakteriesuspensionen delades sedan in i två grupper: i den första gruppen (2 rör) ingen antibiotika sattes, i den andra gruppen som vi lagt till gentamycin antibiotika (50 ng / ml).
2. Bestämning av kolonibildande enheter (CFU)
- För att bestämma cellviabilitet 20 il prover togs från experimentet ungefär var 2 tim inom tidsramen av 24 tim. Seriell utspädning av proverna gjordes och ströks ut på LB-agarplattor och inkuberades över natten vid 37 ° C.
- För varje behandling, de CFUs per plate bestämdes och en jämförelse gjordes mellan tidsperioder och olika behandlingar. Den log reduktion av CFU beräknades såsom beskrivits i Ekv. (1):
Log minskning = Logu-logC [CFU / ml]
Där U är kolonibildande enheter värde vid varje tidpunkt, CFU är den kolonibildande enheten medan enheterna av CFU / ml lika med:
CFU / ml = (antal kolonier x utspädningsfaktor) / (volym ympade)
Och C är CFU som finns i kontrollprovet vid starttiden. Observera att U betecknar kolonibildande faktor vid mätning ögonblick. - Utspädningsfaktorn är antalet spädningar medan i var och en av dem koncentrationen av bakterierna reducerades med en faktor 10. Den ympade volymen var alltid 200 mikroliter och det är relaterat till storleken på vår provrör.
Därför att sammanfatta koncentrationen synvinkel, var gentamycin antibiotika vid koncentration av 50 mikrogram / ml. När det gäller bakterier, fram till slutet avprocessen hade vi totalt 8 utspädningar. Varje utspädning med en faktor av 10 och det gjordes i tuber med 200 pl. Utgångspunkten var 20 pl av prover läggas till den 200 | il röret (och sålunda den ursprungliga koncentrationen var 20/200C 0 = 0.1C0 med C 0 var den inledande koncentrationen i 20 | il prov) och den slutliga koncentrationen reducerades med 8 storleksordningar på grund av de åtta utspädningar.
Tre. Illumination
- CW Nd: YAG-laser (våglängd av 532 nm och en genomsnittlig optisk effekt av 200 mW) delades upp i två optiska vägar med hjälp av optisk 50% / 50% stråldelaren. Balken diametern var omkring 10 mm. Den exponeringstid var 24 tim.
- Q-switchad pulsad Nd: YAG-laser (våglängd av 532 nm, medeleffekt på 300 mW och optisk toppeffekt på 2,5 MW) var också uppdelad i två banor med optisk 50% / 50% stråldelare. Den fläckdiameter var 6 mm. Pulsbredden av Q-switchade lasrar var 6 nsek och repetitionshastighet var 15 Hz. Dengenomsnittlig effekttäthet var 106 mW / cm 2 och toppeffekttäthet var 8,83 kW / mm 2. Den exponeringstid var 24 tim.
Notera att den bakteriella suspensionen omrördes under bestrålning och det hölls under lämpliga odlingsbetingelser för bakteriell tillväxt (i alla rör fanns Luria Broth-medium för att tillåta bakterierna att växa).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lasern baserad installation visas schematiskt i figur 1. Den första försöksbetingelse utnyttjade en CW Nd: YAG-laser med våglängd av 532 nm (den andra övertonen av Nd: YAG) och genomsnittlig optisk effekt av 200 mW. Denna stråle delades upp i två optiska vägar med hjälp av optisk 50% / 50% stråldelaren så att varje delad stråle hade effekt på 100 mW. Balken diametern var omkring 10 mm och således effekttätheten var ungefär 100 mW / cm 2. Den exponeringstid var 24 tim. Även om belysningen strömmen är relativt hög är det inte tillräckligt hög för att orsaka uppvärmning av provet.
Det andra försöksbetingelse utnyttjade en Q-switchad pulsad Nd: YAG-laser med våglängd av 532 nm (andra övertonen) och spot diameter av 6 mm. Den genomsnittliga effekten var 300 mW och optisk toppeffekt på 2,5 MW. Pulsbredden av Q-switchade lasrar var 6 nsek och repetitionshastighet var 15 Hz. Denna balk var också uppdelad i två banor med optisk50% / 50% stråldelaren. Den genomsnittliga effekttäthet var ca 100 mW / cm 2 och toppeffekttäthet var 8,83 kW / mm 2. Denna toppeffekttäthet motsvarar energi flyt av 88,3 μJ / mm 2 per puls som varje puls var 10 nsek länge i tidsdomänen. Den exponeringstid var 24 tim. Båda experimenten utfördes under liknande odlingsbetingelser utan-ljusexponering (dvs. med och utan gentamycin) som fungerade som en kontrollgrupp.
I figur 2 (a) och 2 (b) den uppnådda effekten beror på belysning av proven med CW laserljus och med Q-switchad laser respektive med och utan antibiotika på P. aeruginosa presenteras.
I de prover som inte exponerats för ljus (dvs kontroll) sågs ingen minskning av cellernas viabilitet med eller utan gentamycin behandling. Detta resultat tyder på att bakterierna är resistenta mot gentamycin behandling, imiterasituationen ofta stött på kliniken.
Laserljuset ensam också inducerade inte någon dödande heller. Däremot minskade kombination av laserljus och gentamycin bakterier livskraft genom flera storleksordningar. Mest framträdande effekt mättes efter 24 h i vilken kombinationen av antingen CW eller Q-switchad laser reducerade viabilitet med åtta storleksordningar jämfört med de mätresultat som erhållits i kontrollgruppen (enbart antibiotika eller ljus ensam).
Detta är ett viktigt resultat som kan tyda på en lösning av behandling för denna typ av antibiotikaresistenta bakterier. Den omständigheten att flera timmar krävs för att erhålla en effektiv avdödning av bakterierna minskar inte den kliniska potentialen av denna metod, eftersom den föreslagna behandlingen kan införlivas i katetrar och andra anordningar som används på sjukhus. Till exempel i figur 3 presenterar vi ett exempel på en konstruerad kateter i vilken utövertion till den flytande injektionen kanalen finns flertal hål gör det möjligt att samtidigt sprida korrekt belysning i den infekterade orgel.
Antalet prov som används för statistiken var 6 (det fanns en eller två fall av några av rören som råkar var förorenade och sedan de togs ur statistiken). Den p-värde var lägre än 0,05.
Observera att vi inte upprepar våra experiment för olika koncentrationerna av antibiotika. I alla våra experiment var koncentrationen mycket hög. Skälet till detta var att bättre demonstrera styrkan i vår strategi, som om i den högsta koncentrationen bakterierna fortfarande inte påverkades av de antibiotika utan belysning och förstördes med belysning, kommer det naturligtvis hända för lägre koncentrationer.
Ett av motiven för att välja belysning våglängden var att välja en våglängd för vilken bacteria och antibiotika är transparenta. Detta visas i figur 4. Extra motivation för att använda våglängden 532 nm laser berodde på dess tillgänglighet i vårt labb och på grund av det faktum att det får oss också att få högre belysning effekt (jämfört med vanlig vit ljuskälla med spektrala filter) samt tuning kapacitet för kraft och för den temporala beteendet hos belysningen.
Figur 1. . Bakterier belysning inställning Lasern var antingen CW Nd: YAG-laser eller Q-switchad pulsad Nd: YAG-laser. Till vänster kan man se bilden av den experimentella uppställning där lasern är uppdelad mellan två rör, ett med antibiotika och ett utan den, för att belysa båda i identiska förhållanden. Båda rören är läget ed på en omrörare. Schematisk skiss av experimentuppställningen visas i den högra delen av figuren.
Figur 2. (A). Effekt av CW-laser och gentamycin på P. aeruginosa. Prover upplyst med en CW laserljus (effekt på 100 mW) med och utan gentamycin (50 ng / ml). Medelvärdet av tre experiment presenteras. (B). Effekt av Q-switchad laser och gentamycin på P. aeruginosa. Prov belystes med Q-switchad laser ljus (1,65 MW) med och utan gentamycin (50 | ig / ml) på P. aeruginosa livskraft. Medelvärdet av tre experiment presenteras.
4370/4370fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
Figur 3. Den föreslagna kateter baserad enhet för biomedicinsk behandling mot P. aeruginosa. Prickarna i figuren representerar ljusspridande punkter orsakar ljuset att spridas in i den behandlade vävnaden.
Figur 4 Absorptionen spektrum (i au) runt våglängd av 532 nm för:. (A). Bakterierna, (b). Den gentamycin. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ljusbehandling har varit ett område av avancerad tvärvetenskaplig forskning på senare år framstår som en lovande metod för behandling många sjukdomar. I detta sammanhang är användningen av ljus i det synliga området har studerats. Till exempel har det visat sig att infekterade sår kan läkas mer effektivt genom att exponera dem för intensivt synligt ljus för steriliseringsändamål. Verkningsmekanismen för denna strategi har visat sig vara genom induktion av Ijusinducerade syreradikaler (ROS) som dödar bakterierna 11.
Tidigare studier 6 har visat betydligt större mängder av ROS i bakterier belysta med blått ljus än de induceras av rött och nära infrarött ljus. Detta förklarar varför de flesta bevis i litteraturen koncentrerar sig på den bakteriedödande effekten av blått ljus.
Ett annat färskt exempel för användning av laserljus för att bekämpa resistenta bakterier demonstrerades genom KrespI et al. 12. I denna studie laser genererade shockwave teknik användes för att utrota biofilmer. Genom att använda en miniatyr Q-switchad Nd: YAG-laser och tunna fibrer, speciella prober genererade plasma formation som producerade shockwave effekt. Författarna visade att denna metod var att effektivt kunna störa P. aeruginosa biofilms in vitro.
Det tillvägagångssätt vi har presenterat i denna studie var något annorlunda 13 som vi försökt att öka effektiviteten av icke-foto-antimikrobiella medel med laserljus. Våra resultat tyder på att genom att kombinera antibiotikabehandling med belysning, kan den antimikrobiella aktiviteten dramatiskt ökas.
I själva verket från en helt resistent fenotyp, observerades i enbart antibiotika bakterierna blev känslig i närvaro av antibiotika och ljusbehandling. Verkningsmekanismen för denna effekt är inte klart och kommer att kräva ytterligare utrederjon. Men i de Electron-resonans (EPR) mätningar som vi har utfört för att undersöka om ROS uppstår under behandlingen, var ingen signifikant skillnad mellan de olika behandlingarna erhålls 13. Dessa resultat tyder på att effekten av den kombinerade behandlingen inte innefattar ROS-produktionen och olika mekanismer måste beaktas. Det kan hypotes att ljusbehandlingen ändrar membranpermeabiliteten och slutligen gör det möjligt för antibiotika för att tränga in i bakteriecellen vilket gav dess dödande.
Även om mekanismen för driften inte utforskats till fullo, vårt tillvägagångssätt lyfta fram potentialen av kombinerad terapi av ljus med kommersiell antibiotikum som kan ha kasseras till följd av antimikrobiell resistens medan genom att tillämpa denna kombination kan nu återanvändas effektivt i kliniker.
Uppenbarligen såsom noterats i manuskriptet, är belysning av flera timmar krävs för att en Hance effekten av antibiotika. Detta är verkligen en nackdel med den föreslagna metoden. Förverkligandet av en sådan belysning kan erhållas t.ex. genom att installera ljuskällan inuti katetrar (såsom föreslagits av figur 3). I tillägg till detta, om såret är extern speciell banding som gips med ljuskällan kan läggas på toppen av såret och belysa den i flera timmar, t.ex. medan patienten sover på natten. Om infektionen är interna och patienten är på sjukhus, och han / hon är ansluten till infusionspåse i flera timmar, för vissa organ en belysning kanal såsom ett endoskop eller en speciell fiber kan kontaktas på orgel och ständigt tända den (med tillämpas antibiotikabehandling) medan patienten är på sjukhus (exakt som infusionspåsen är ansluten till patienten i många timmar). Vi instämmer helt i att metoden inte är bra för behandling av allmänt infekterade organ.
nt "> Observera att i detta manuskript visar vi fördelen med den föreslagna tekniken för snabb och praktisk tillämpning men för att uppnå detta andra studier är nödvändiga, såsom in vivo-experiment. Toxiciteten studie om fibroblast eller epitelceller kommer att vara användbara såväl eftersom de studier som kommer att visa mekanismen för den föreslagna terapin i bakterieceller krävs. Dessutom i denna uppsats har vi antagit att lätta inducerade förändringar av bakteriemembranet som gjorde det mer genomsläpplig för antibiotikan. Självklart saker kommer att vara annorlunda i en . klinisk miljö där bakteriella infektioner beror på biofilmer Sedan finns det två stora problem:. Bakterieskikt blir mer motståndskraftig jämfört med sina motsvarigheter plankton och penetration av antibiotika i biofilmen massan kommer att begränsas därför undersöka effekterna av ljus och gentamycin på en P. aeruginosa biofilm modell är syftet med vår framtida studie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. Laser disruption of biofilm. Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
