Summary
وتبين لنا أن جهاز الطبية الحيوية المتقدمة التي تنطوي مرئية علاج يعتمد على الليزر مستمر أو نابض أن يتم جنبا إلى جنب مع العلاج بالمضادات الحيوية (الجنتاميسين)، والنتائج في تأثير متناغم ذات دلالة إحصائية مما يؤدي إلى انخفاض في قابلية
Abstract
مؤخرا كانت هناك العديد من المنشورات على تأثير مبيد للجراثيم من الضوء المرئي، ومعظمهم من يدعي ذلك الجزء الأزرق من الطيف (400 نانومتر 500 نانومتر) هو المسؤول عن قتل مسببات الأمراض المختلفة 1-5. واقترح تأثير الضوئية من الضوء الأزرق أن تكون نتيجة لأنواع الاكسجين التفاعلية التي يسببها ضوء (ROS) تشكيل كتبها الضيائية البكتيرية الذاتية والتي تمتص معظم الضوء في المنطقة الزرقاء 4،6،7. وهناك أيضا تقارير عن تأثير مبيد الأحياء من الأحمر وبالقرب من الأشعة تحت الحمراء 8، وكذلك الضوء الاخضر 9.
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير طريقة التي سمحت لنا لتوصيف تأثير ارتفاع الطاقة الخضراء (الطول الموجي من 532 نانومتر) المستمرة (CW) ونابض سؤال للتحول (QS) الضوء على الزائفة الزنجارية. باستخدام هذا الأسلوب نحن أيضا دراسة تأثير الضوء الأخضر جنبا إلى جنب مع العلاج بالمضادات الحيوية (الجنتاميسين) على الجدوى البكتيريا. P. الزنجارية هو تيار مترددommon الممرض الانتهازية noscomial تسبب الأمراض المختلفة. سلالة مقاومة للمضادات الحيوية المختلفة إلى حد ما ويحتوي على العديد من توقع AcrB / مكس من نوع RND المتعددة نظم هروب رأس المال 10.
الطريقة المستخدمة ثابتة مرحلة البكتيريا سالبة الجرام التي تعيش بحرية (P. الزنجارية سلالة PAO1)، ونمت في مرق لوريا (LB) متوسطة تتعرض لQ-تبديل و / أو CW الليزر مع وبدون إضافة للجنتاميسين مضاد حيوي. تقرر بقاء الخلية في نقاط زمنية مختلفة. أظهرت النتائج المتحصل عليها أن العلاج بالليزر وحدها لم يقلل من بقاء الخلية مقارنة مع الشاهد غير المعامل وأن العلاج الجنتاميسين وحدها أدت فقط إلى انخفاض سجل 0.5 في العد قابلة للP. الزنجارية. ليزر مجتمعة والعلاج الجنتاميسين، ومع ذلك، أدى إلى تأثير متناغم وجدوى P. تم تخفيض الزنجارية بنسبة 8 سجل ل.
الطريقة المقترحة يمكن أن يكون أبعد implemented عبر تطوير القسطرة مثل جهاز قادر على ضخ محلول مضاد حيوي في الجهاز المصاب في حين إلقاء الضوء في الوقت نفسه منطقة مع الضوء.
Protocol
1. ثقافة البكتيرية
- P. سالبة الجرام وقد نمت الزنجارية سلالة PAO1 في مرق لوريا (LB) عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- ثم تم طرد ثقافة الخلايا في 7،500 دورة في الدقيقة (طلقة في الدقيقة الواحدة) لمدة 5 دقائق، وتمت إزالة طاف.
- كان معلق البكتيريا في 10٪ LB وإعادة نمت لمدة 2 ساعة أخرى للسماح للثقافة لإعادة إدخال مرحلة ثابتة.
- ثم تم تقسيم التعليق البكتيريا إلى مجموعتين: في المجموعة الأولى (2 أنابيب) تم إضافة أي مضاد حيوي، في المجموعة الثانية أضفنا المضاد الحيوي جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل).
2. تحديد الوحدات المكونة للمستعمرة (كفو)
- لتحديد بقاء الخلية أخذت 20 عينة ميكرولتر من التجربة تقريبا كل 2 ساعة ضمن الإطار الزمني من 24 ساعة. وأدلى التخفيف المتسلسل للعينات ومطلي على لوحات أجار LB وحضنت بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- لكل معاملة، وCFUs لكل بلاتتم تحديد ه وتمت المقارنة بين الفترات الزمنية والعلاجات المختلفة. تم احتساب الحد من دخول كفو كما هو موضح في المعادلة. (1):
سجل الحد = وغو-LogC [كفو / مل]
حيث U هي مستعمرة تشكيل قيمة الوحدات في كل نقطة زمنية؛ كفو هي الوحدة المكونة للمستعمرة في حين أن وحدات من كفو / مل تساوي:
كفو / مل = (عدد من المستعمرات عامل التخفيف X) / (المجلد تلقيح)
وC هو كفو وجدت في العينة الضابطة في وقت البدء. لاحظ أن U يعين مستعمرة تشكيل عامل في لحظة القياس. - عامل التخفيف هو عدد التخفيفات في حين في كل واحد منهم تم تخفيض تركيز البكتيريا بمعامل 10. بلغ حجم تلقيح دائما 200 لتر الصغرى ويرتبط ذلك إلى حجم أنبوب الاختبار.
ولذلك لتلخيص نقطة تركيز للعرض، كانت المضادات الحيوية الجنتاميسين في تركيز 50 ميكروغرام / مل. وفيما يتعلق البكتيريا، حتى نهايةعملية كان لدينا العام 8 التخفيفات. كان كل التخفيف بمعامل 10 و تم القيام به في أنابيب من 200 ميكرولتر. كانت نقطة الانطلاق 20 ميكرولتر من العينات وأضاف في أنبوب ميكرولتر 200 (وبالتالي كان التركيز الأولي 20/200C 0 = 0.1C0 مع C 0 يجري التركيز الأولي في ميكرولتر من 20 عينة) وتم تخفيض تركيز النهائي بنسبة 8 أوامر من حجم نظرا ل8 التخفيفات.
3. إضاءة
- CW الثانية: YAG الليزر (الطول الموجي من 532 نانومتر، ومتوسط الطاقة الضوئية من 200 ميغاواط) وتنقسم إلى مسارين الضوئية باستخدام البصرية 50٪ / 50٪ الخائن شعاع. كان شعاع قطره حوالي 10 ملم. وكانت مدة التعرض على مدار 24 ساعة.
- سؤال للتحول نابض الثانية: YAG الليزر (الطول الموجي من 532 نانومتر، متوسط القوة من 300 ميغاواط وذروة السلطة البصرية من 2.5 ميغاواط) انقسمت أيضا إلى مسارين باستخدام البصرية 50٪ / 50٪ الخائن شعاع. كان بقعة قطرها 6 ملم. كان العرض نبض Q-تبديل ليزر 6 NSEC وكان معدل تكرار 15Hz. الوكان متوسط كثافة الطاقة 106 ميغاواط / سم 2 وكانت كثافة الطاقة الذروة 8.83 كيلو واط / مم 2. وكانت مدة التعرض على مدار 24 ساعة.
علما بأن تعليق البكتيرية أثار خلال التشعيع والإبقاء عليها في ظل ظروف ثقافة مناسبة لنمو البكتيريا (في جميع أنابيب كان هناك مرق لوريا المتوسطة للسماح للبكتيريا لتنمو).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد الإعداد يعتمد على الليزر تخطيطي في الشكل 1. الشرط التجريبية الأولى والثانية استخدمت CW: YAG الليزر وجود الطول الموجي من 532 نانومتر (التوافقي الثاني من الثانية: YAG) ومتوسط الطاقة الضوئية من 200 ميغاواط. تم تقسيم هذا التردد في مسارين الضوئية باستخدام البصرية 50٪ / 50٪ الخائن شعاع مثل أن كل شعاع الانقسام كان قوة 100 ميغاواط. كان شعاع قطره حوالي 10 ملم، وبالتالي كانت كثافة الطاقة حوالي 100 ميغاواط / سم 2. وكانت مدة التعرض على مدار 24 ساعة. على الرغم من أن قوة الإضاءة عالية نسبيا، ليست عالية بما يكفي للتسبب تسخين العينة.
الشرط التجريبية الثانية المستخدمة والثانية Q-تبديل نابض: YAG الليزر وجود الطول الموجي من 532 نانومتر (الثاني التوافقي) وقطرها بقعة من 6 ملم. وكان متوسط القوة 300 ميغاواط وذروة الطاقة الضوئية من 2.5 ميغاواط. كان العرض نبض Q-تبديل ليزر 6 NSEC وكان معدل تكرار 15Hz. تم تقسيم هذا التردد أيضا إلى مسارين باستخدام البصرية50٪ / 50٪ الخائن شعاع. كانت كثافة الطاقة في المتوسط حوالي 100 ميغاواط / سم 2 وكثافة ذروة السلطة كان 8.83 كيلو واط / مم 2. هذه الكثافة ذروة السلطة ما يعادل الطاقة الطلاقة من 88.3 μJ / مم 2 لكل نبضة كما كان كل نبضة طويلة في المجال الزمني 10 NSEC. وكانت مدة التعرض على مدار 24 ساعة. وأجريت التجارب على حد سواء في ظل ظروف نمو مماثل مع التعرض لا ضوء (أي مع وبدون الجنتاميسين) الذي كان بمثابة السيطرة.
في الشكلين 2 (أ) و 2 (ب) حصلت بسبب الإضاءة من العينات مع CW ضوء الليزر ومع سؤال للتحول الليزر تأثير على التوالي مع وبدون المضادات الحيوية على P. ويرد الزنجارية.
في العينات التي لم تتعرض للضوء (أي السيطرة) لم يكن هناك أي تخفيض في بقاء الخلية مع أو من دون علاج الجنتاميسين. هذه النتيجة تشير إلى أن البكتيريا مقاومة للعلاج الجنتاميسين، ومحاكاةالحالة كثيرا ما تصادف في العيادة.
ضوء الليزر وحده كما لم تحدث أي القتل سواء. ومع ذلك، فإن الجمع بين ضوء الليزر والجنتاميسين خفض البكتيريا الجدوى من قبل عدة أوامر من حجم. تم قياس تأثير الأبرز بعد 24 ساعة التي مزيج من إما CW أو سؤال للتحول الليزر خفض قابلية بنسبة 8 أوامر من حجم بالمقارنة مع القياسات التي تم الحصول عليها في السيطرة على المجموعة (المضادات الحيوية وحدها أو الضوء وحدها).
هذا هو نتيجة المهمة التي قد يقترح حلا لعلاج هذا النوع من البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. حقيقة أن هناك حاجة لعدة ساعات من أجل الحصول على قتل فعالة من البكتيريا لا يقلل من إمكانات السريرية لهذا النهج منذ العلاج المقترح يمكن إدراجها في القسطرة وغيرها من الأجهزة المستخدمة في المستشفى. على سبيل المثال في الشكل (3) نقدم مثالا لتصميم القسطرة التي في عدينشوئها إلى القناة حقن السائل هناك تعددية من الثقوب مما يسمح لنزع فتيل الإضاءة المناسبة في وقت واحد في الجهاز المصاب.
وكان عدد العينات المستخدمة في إحصاءات 6 (كان هناك واحد أو اثنين من الحالات من بعض الأنابيب التي كانت ملوثة عن طريق الخطأ ومن ثم تم اقتيادهم من الإحصاءات). وبلغت قيمة P أقل من 0.05.
لاحظ أننا لم يكرر تجاربنا لمستويات تركيز مختلفة من المضادات الحيوية. في كل من تجاربنا وكان تركيز عالية جدا. وكان السبب في ذلك إلى إظهار أفضل قوة لنهجنا كما لو كان في أعلى تركيز كان لا يزال لا تتأثر البكتيريا من المضادات الحيوية دون إضاءة ودمرت مع الإضاءة، فإنه سيحدث الواضح لتركيزات أقل.
كان واحدا من المبررات لاختيار الطول الموجي الإضاءة لاختيار الطول الموجي للبكتيريا التي(أ) ومضادات حيوية تتسم بالشفافية. ويتجلى هذا في الشكل 4. وكان حافزا إضافيا لاستخدام الطول الموجي 532 نانومتر ليزر نظرا لتوافرها في مختبرنا ويرجع ذلك إلى حقيقة أنه سمح لنا أيضا للحصول على أعلى قوة الإضاءة (مقارنة العادية مصدر الضوء الأبيض مع المرشحات الطيفية)، وكذلك القدرة على ضبط لل السلطة والسلوك الزمني للإضاءة.
الشكل 1. كان البكتيريا الإعداد إضاءة ليزر إما CW الثانية:. YAG ليزر أو Q-تبديل نابض الثانية: YAG الليزر. على اليسار يمكن للمرء أن يرى صورة من الإعداد التجريبية التي يتم تقسيم الليزر بين أنبوبين، واحدة مع المضادات الحيوية واحدة دون ذلك، من أجل إلقاء الضوء على كل منهما في ظروف مماثلة. كلا الأنابيب هي موقف إد على النمام. ويعتبر رسم تخطيطي من الإعداد التجريبية في الجزء الأيمن من الشكل.
الشكل 2 (أ). تأثير CW-الليزر والجنتاميسين على P. الزنجارية. أضيئت عينات مع ضوء الليزر CW (قوة 100 ميغاواط) مع وبدون الجنتاميسين (50 ميكروغرام / مل). يتم تقديم بمعدل 3 تجارب. (ب). تأثير سؤال للتحول الليزر والجنتاميسين على P. الزنجارية. أضيئت عينات مع Q-تحول ضوء الليزر (1.65 ميجاوات) مع وبدون الجنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) على P. الجدوى الزنجارية. يتم تقديم بمعدل 3 التجارب.
4370/4370fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/4370/4370fig3.jpg "/>
الشكل (3). الجهاز القسطرة المقترحة مقرها لعلاج الطبية الحيوية ضد P. الزنجارية. النقاط في الشكل تمثل نقطة تشتت الضوء مما تسبب في ضوء أن يكون منتشر في الأنسجة المعالجة.
الشكل 4 امتصاص الطيف (في الاتحاد الافريقي) حول الطول الموجي من 532 نانومتر من أجل: (أ). البكتيريا، (ب). والجنتاميسين. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان العلاج بالضوء حقل البحوث متعددة التخصصات المتقدمة في السنوات الأخيرة الناشئة باعتبارها نهجا واعدا لعلاج العديد من الأمراض. في هذا السياق استخدام الضوء في المدى المرئي وقد درس على نطاق واسع. على سبيل المثال، فقد وجد أن الجروح المصابة يمكن أن تلتئم بشكل أكثر فعالية عن طريق تعريضها للضوء المرئي مكثفة لأغراض التعقيم. وقد ثبت أن آلية العمل لهذا النهج يتم من خلال تحريض المتطرفين الأكسجين الناجم عن ضوء (ROS) التي تقتل البكتيريا 11.
وقد أظهرت الدراسات السابقة 6 كميات أعلى بكثير من ROS في البكتيريا مضيئة مع ضوء أزرق من تلك التي يسببها الأحمر وبالقرب من ضوء الأشعة تحت الحمراء. وهذا يفسر السبب في أن معظم الأدلة في الأدب تركز على تأثير مبيد للجراثيم من الضوء الأزرق.
وقد تجلى آخر الأمثلة الحديثة لاستخدام ضوء الليزر لمحاربة البكتيريا المقاومة من قبل Krespأنا وآخرون 12. وفي هذا الليزر الدراسة تم استخدام التكنولوجيا وحدثت الهزة الارضية ولدت للقضاء على الأغشية الحيوية. باستخدام نموذج مصغر Q-تبديل الثانية: YAG الليزر وألياف رقيقة، تحقيقات خاصة ولدت تشكيل البلازما التي تنتج تأثير وحدثت الهزة الارضية. أظهر الكتاب أن هذا الأسلوب كان قادرا على تعطيل فعالية P. الأغشية الحيوية الزنجارية في المختبر.
وكان النهج الذي عرضناه في هذه الدراسة 13 مختلفة بعض الشيء كما حاولنا لزيادة فعالية غير الضيائي عامل مضاد للميكروبات باستخدام ضوء الليزر. نتائجنا تشير الى أنه من خلال الجمع بين العلاج بالمضادات الحيوية مع الإضاءة، والنشاط البكتيري ويمكن زيادة بشكل كبير.
في الواقع، من النمط الظاهري مقاومة تماما، لوحظ في المضادات الحيوية وحدها أصبحت البكتيريا الحساسة في وجود العلاج بالمضادات الحيوية والضوء. آلية عمل هذا التأثير ليس واضحا، وسوف تحتاج إلى مزيد من investigatأيون. ومع ذلك، في الرنين (EPR) القياسات الكترون ممغطس أننا قد أجريت لدراسة ما إذا كان يتم إنشاء ROS خلال العلاج، تم الحصول عليها لا يوجد فرق كبير بين العلاجات المختلفة 13. وتشير هذه النتائج إلى أن تأثير العلاج جنبا إلى جنب لا تنطوي على إنتاج ROS وآليات مختلفة يجب النظر فيها. ويمكن الافتراض أن العلاج ضوء تغيير نفاذية الغشاء ويسمح في نهاية المطاف المضادات الحيوية للتسلل الى خلية البكتيريا مما أسفر عن قتله.
على الرغم من أن آلية العملية لم تستكشف بالكامل، نهجنا تسليط الضوء على إمكانات الجمع بين العلاج من الضوء مع المضادات الحيوية التجارية التي قد يكون تم التخلص منها بسبب مقاومة مضادات الميكروبات في حين من خلال تطبيق هذا المزيج يمكن الآن إعادة استخدامها بشكل فعال في العيادات.
كما أشار الواضح في المخطوط، وهناك حاجة إضاءة لعدة ساعات من أجل EN هانس فعالية من المضادات الحيوية. هذا هو في الواقع العيب من النهج المقترح. تحقيق مثل هذه الإضاءة يمكن الحصول على مثل عن طريق تثبيت مصدر إضاءة داخل القسطرة (على النحو الذي اقترحه الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، إذا كان الجرح خارجية خاصة النطاقات كما الجص مع مصدر إضاءة يمكن وضعها على رأس الجرح وإلقاء الضوء عليه لعدة ساعات على سبيل المثال في حين أن المريض هو النوم في الليل. إذا كانت العدوى الداخلية والمستشفى للمريض وانه / انها متصلة كيس التسريب لعدة ساعات، بالنسبة لبعض الأجهزة قناة الإضاءة مثل المنظار أو الألياف الخاصة يمكن اقترب إلى الجهاز وتضيء باستمرار ذلك (مع تطبيق العلاج بالمضادات الحيوية)، في حين في المستشفى المريض (تماما كما يتم توصيل كيس التسريب للمريض لعدة ساعات). ونحن نتفق تماما على أن النهج ليست جيدة لعلاج المصابين الأجهزة عموما.
NT "> لاحظ أن في هذا المخطوط نقدم لك مجموعة من الاستفادة من هذه التقنية المقترحة لتطبيق سريع وعملي ولكن من أجل تحقيق ذلك دراسات أخرى ضرورية مثل في التجارب المجراة. الدراسة السمية على الخلايا الليفية أو الخلايا الظهارية سوف يكون من المفيد أيضا كما يطلب من الدراسات التي تثبت آلية العلاج المقترحة في الخلايا البكتيرية. وبالإضافة إلى ذلك في هذه الورقة لقد افترض أن التغيرات التي يسببها ضوء غشاء البكتيريا التي جعلت من أكثر نفاذا إلى المضادات الحيوية. ومن الواضح أن الأمور ستكون مختلفة في . إعداد سريرية حيث من المقرر أن الأغشية الحيوية الالتهابات البكتيرية ثم هناك مشكلتين رئيسيتين: سوف البكتيريا بيوفيلم تكون أكثر مقاومة مقارنة مع نظرائهم العوالق والاختراق من مضادات الميكروبات في كتلة بيوفيلم سيكون محدودا لذلك، واستكشاف تأثيرات الضوء والجنتاميسين على والزنجارية P. نموذج بيوفيلم هو الهدف من دراستنا في المستقبل.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lauria Broth | Difco | 241420 | |
| Gentamycin | Sigma | G1914 | |
| Bacto Agar | Difco | 231710 |
References
- Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study. Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm. Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light. Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. A possible Mechanism for visible light induced wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).
- Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing. Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).
- Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn. Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).
- Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro. J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).
- Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro. Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 952-964 (2000).
- Hamblin, M. R., Demidova, T. N. Mechanisms of low level light therapy. Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).
- Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L.
- Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic. Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).
