Summary
نحن لشرح كيفية استخدام تقنية التغذية رني لاسقاط الجينات المستهدفة والنمط الظاهري نقاط حجم الجسم في
Abstract
RNA المزدوج حبلا بوساطة التدخل (رني) هو استراتيجية فعالة لاسقاط الهدف الجين 1-3 التعبير. وقد تم تطبيق النموذج على الأنظمة بما في ذلك العديد من اللافقاريات والنباتات والفقاريات. هناك طرق مختلفة لتحقيق رني 4،5 في الجسم الحي. على سبيل المثال، قد يتم تحويل الجينات المستهدفة إلى ناقلات رني، ومن ثم إما بشكل دائم أو عابر تحويلها إلى خطوط الخلية أو الخلايا الأولية لتحقيق تأثيرات الجينات ضربة قاضية، وقد توليفها بدلا من مزدوج الجديلة أليغنوكليوتيد] من الجينات المستهدفة محددة (رني oligos) تكون عابر ويمكن تصنيعه أو microinjected المزدوج حبلا جزيئات الحمض النووي الريبي في الكائن الحي؛ تحويلها إلى خطوط الخلية أو الخلايا الأولية لإسكات الجينات المستهدفة. منذ C. الديدان الخيطية ايليجانس يستخدم البكتيريا كمصدر للغذاء، وإطعام الحيوانات مع البكتيريا معربا عن نقرا مزدوجا حبلا الحمض النووي الريبي الجينات المستهدفة ضد يوفر استراتيجية قابلة للتطبيق 6. هنا نقدم لتغذية رنيطريقة الجسم ليسجل حجم النمط الظاهري. حجم الجسم في C. وينظم ايليجانس في المقام الأول من قبل TGF-β - يجند مثل DBL-1، لذلك هذا الاختبار هو المناسب لتحديد TGF-β مكونات يشير 7. كنا سلالات مختلفة بما في ذلك سلالات شديدة الحساسية 2 رني لتكرار التجارب التغذية رني. وأظهرت النتائج أن قوة الرد السريع دينا-3 سلالة قدم لنا أفضل النمط الظاهري رني المتوقعة. هذه الطريقة سهلة لتنفيذ، واستنساخه، وكميا بسهولة. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يقلل من استخدام المعدات المتخصصة، لذلك هي مناسبة لأصغر المختبرات أو في المؤسسات الجامعية التي في الغالب.
Protocol
1. إعداد لوحات التغذية رني حمل الهدف تسلسل الجينات
- في حالة استخدام المكتبات المتاحة تجاريا رني (على سبيل المثال من علوم الحياة العلوم الاحيائية المصدر)، انتقل إلى الخطوة 1.4. بدلا من ذلك، استنساخ تسلسل الجينات المستهدفة في ناقلات L4440، دودة تستخدم عادة رني البلازميد 8، من بروتوكول الاستنساخ القياسية.
- تحويل البلازميد المؤتلف في السلالة البكتيرية HT115 (DE3)، والثقافة، منهم على لوحات أجار LB مع 25 ميكروغرام / مل و 12.5 كربنيسيلين ميكروغرام / مل التتراسيكلين، واختيار واحد استنساخ لاستخدامها في المستقبل.
- وفي الوقت نفسه، تحويل L4440 ناقلات الفارغة في السلالة البكتيرية HT115 لاستخدام عنصر تحكم عن التجارب.
- الثقافة على حد سواء والمؤتلف فارغة L4440-تحمل البكتيريا في 1 مل مرق LB مع 100 ميكروغرام / مل بين عشية وضحاها في الأمبيسلين 37 ° C. لا يتم إضافة التتراسيكلين يرجع ذلك إلى حقيقة أنه يقلل رني الكفاءة.
- إضافة آخر LB 5 مل مرق مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في cultu بين عشية وضحاهاإعادة، احتضان لمدة ساعة 4-6 في 37 ° C.
- البذور 0.5 مل المؤتلف أو فارغة L4440-تحمل ثقافة البكتيرية على لوحات دودة رني. تسمية جميع لوحات مع اسم استنساخ.
- بمناسبة احتضان بين عشية وضحاها لوحات وعند 37 ° C لزراعة العشب البكتيرية، وهذه هي لوحات رني مع أو بدون تسلسل الجينات المستهدفة. وينبغي إعداد لوحات على الأقل 2 لكل حالة.
2. الديدان الثقافة على لوحات التغذية رني
- لهب تعقيم غيض من دودة اختيار البلاتين السلك. استخدام دودة اختيار لاختيار 6-10 مرحلة اليرقات الرابعة (L4) المنحرفين إلى كل لوحة رني الذي يحتوي L4440 المؤتلف أو فارغة، والحيوانات واستخدام البكتيريا كمصدر للغذاء.
- اسمحوا المنحرفين تنمو بنسبة 20 ° C (شرط الثقافة القياسية لايليجانس C.) بين عشية وضحاها، وسوف تصبح صغار البالغين في اليوم التالي.
- 6-10 نقل الشباب إلى لوحة جديدة رني المسمى المقابل وإعدادها.
- السماح للوضع البيض البالغين لمدة 4-6 ساعة، ثم إزالة جميع البالغين من لوحة، وهذا هو خطوة لمزامنة ذرية. مرة واحدة يتم إزالة الأمهات، يبدأ العد الوقت. هذا هو صفر الوقت.
- احتضان لوحات عند 20 درجة مئوية للسماح للحيوانات تنمو لمرحلة إنمائية محددة، وفي هذا البروتوكول، نختار الشباب للتحليل المظهري. لknockdowns التي تنمي بمعدل طبيعي، 72 ساعة حضانة كافية للحيوانات لتصبح صغار البالغين. ومع ذلك، الجينات المختلفة تؤثر على التنمية الحيوانية بشكل مختلف. إذا رني يؤدي إلى الحيوانات تنمو بمعدل مختلفة، يمكن تحديد تلك الشباب والموارد البشرية لا يزيد عن ال 24 الماضية L4 مع التنمية فرجي المنجزة والأجنة 2-6 في الرحم (إذا الخصبة). لتحديد مراحل النمو الأخرى، يتعين على المحقق استخدام وتطوير الغدد التناسلية فرجي كدليل.
3. نمط ظاهري نقاط حجم الجسم من الديدان المعالجة رني
- وضع طبقتين من الأشرطة الملونة التسمية على شريحة زجاجية. جعل اثنين منالشرائح الزجاجية حد ذاتها. ثم، ضع شريحة زجاجية جديدة في بين الشرائح اثنين مع الشريط. تذوب الاغاروز 2٪ في الماء، وتطبيق قطرة واحدة إلى مركز للشريحة زجاجية جديدة؛ ثم اضغط على شريحة زجاجية الثاني على أعلى لجعل طبقة رقيقة من 2٪ كما هو موضح سابقا الاغاروز 9.
- بمجرد طدت الاغاروز، إزالة شريحة زجاجية الأعلى؛ الشريحة مع لوحة الاغاروز مستعد لتحميل الديدان. الشريحة التسمية مع اسم استنساخ.
- إضافة 10 ميكرولتر 25 مم 3 نان لوحة الاغاروز؛ اختيار الحيوانات 30-40 في الحل 3 نان لشل لهم؛ ثم وضع على رأس ساترة؛ تكرار لكل من المؤتلف وفارغة L4440-تحمل رني معاملة الحيوانات.
- صورة الديدان تحت المجهر تشريح باستخدام عدسة 2.5X الهدف، وهنا نستخدم لايكا الكاميرا الرقمية مع دعم Qcapture البرمجيات.
- للمعايرة، والتقاط صورة أولا من حاكم ميكرومتر القياسية. ثم فتح الصورة في صورة برو البرمجيات، وانقر على "التدبير" واختيار "المعايرة" ثم اختر"معالج معايرة المكانية". مع "معايرة الصورة النشطة" المختارة، انقر على "التالي". إدخال اسم لمعايرة وضمان أن يتم تعيين وحدة المرجعية المكانية لميكرومتر. ثم، تحقق من "المعايرة إنشاء مرجع" ثم انقر زر "التالي". انقر على "خط المرجعية التعادل." وهناك شريط مقياس إشارة تظهر. إعادة شريط النطاق لتتناسب مع طرفي ميكرومتر، ثم تشير إلى أن الإشارة إلى 1،000 وحدة. انقر على زر "موافق"، "التالي"، و "إنهاء".
- مرة واحدة يتم معايرة البرنامج، افتح صورة دودة. ثم، حدد ضمن القائمة "إجراء"، حدد "المعايرة" ثم انقر على "اختيار المكانية". في سحب أسفل القائمة، حدد اسم الملف الذي تم إنشاؤه لمعايرة ميكرومتر. ثم، ضمن القائمة "إجراء"، حدد "القياسات". في النافذة التي تفتح، حدد أداة مجانية رسم وتتبع الخط من خلال مركز جسم الحيوان من الرأس الى الذيل مع فأرة الكمبيوتر (الشكل 1). وسيتم إبلاغ طول في الإطار. الآنلديك مجموعتين من البيانات: طول الجسم من الحيوانات تعامل مع الجينات المستهدفة رني والحيوانات تحكم تعامل مع ناقلات L4440 فارغة.
- تصدير قياسات طول لملف Microsoft Excel، أو غيرها من البرامج الإحصائية المناسبة. تحليل البيانات عن طريق حساب المتوسط والانحراف المعياري لكل عينة. ثم قارن الطلاب في العينات باستخدام اختبار t.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في بحثنا، ونحن نركز على تنظيم حجم الجسم عن طريق المسار DBL-1/TGF-β. فقدان وظائف من نتائج مسار DBL-1 في حجم الجسم الصغيرة، بما في ذلك أقصر من طول الجسم مقارنة مع الحيوانات البرية من نوع 7،10،11. وهكذا، شاشات لC. المسوخ ايليجانس حجم الجسم قادرة على تحديد مكونات الإشارات TGF-β والمعدلات. وتوسطت DBL-1 إشارة من قبل الحفظ TGF-β إشارة تنبيغ مسار يتضمن مستقبلات سطح الخلية وبين الخلايا محولات إشارة Smad 12. لاختبار فعالية رني عن طريق تغذية لتحديد حجم الجسم المسوخ، استخدمنا هذه التقنية لهدم مكونات مسار DBL-1: dbl-1/ligand؛ SMA-2، SMA-3 sma-4/Smads،، و sma-6/receptor. لدراستنا، وكنا مختلفين رني شديدة الحساسية C. ايليجانس سلالات لأداء التجربة: ERI-1؛ لين-15B وقوة الرد السريع 13،14-3. وفي الوقت نفسه، كنا أيضا N2 (ستاndard من النوع البري) سلالة ولين 36-، وهو عنصر في مسار لين-15 التي رني حساسية مشابه لذلك N2 13. نتائجنا (الشكل 2) تبين أن كل هذه السلالات عرض حجم الجسم قصيرة النمط الظاهري كما هو متوقع (p <0.001)، إلا SMA-6 رني في الخلفية-36 لين. في قوة الرد السريع-3 الخلفية، كانت أطوال الجسم من الشباب بعد العلاج رني 84 ~ 95٪ من ناقلات وحدها. في ERI-1؛ لين-15B الخلفية أطوال الجسم، من الشباب بعد رني كان 68 ~ 86٪ من الحيوانات السيطرة. مقارنة مع لين وN2-36 سلالات، سواء من الحساسية رني سلالات قوة الرد السريع وERI-3 1-؛ لين-15B كانت أكثر حساسية.
الشكل 1. يتم قياسه الصور ممثل طول جسم الحيوان A. صورة الحيوان قبل القياس.؛
الشكل 2. عرض طول الجسم من الحيوانات التي تم المعطل مكونات DBL-1 عن طريق الممر طريقة التغذية رني. الحيوانات رني في جميع هذه السلالات الخلفية طول الجسم قصيرة النمط الظاهري كما هو متوقع (p <0.001)، إلا SMA-6 رني في لين-36 الخلفية. أظهرت لين-15B سلالات أقوى من ذلك النمط الظاهري من لين-36 N2 والخلفيات؛ رني من قوة الرد السريع وERI-3-1.
الشكل 3. د التخطيطيescription استخدام استراتيجية التغذية رني للكشف عن الجينات المرشحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن لدينا وصف طريقة لتحديد حجم الجسم المسوخ معيبة من C. ايليجانس بواسطة رني التغذية. هذه الطريقة تنطبق على تحديد مكونات الإشارات TGF-β. من الحفظ للغاية منذ هذه المكونات من خلال التطور 15، شاشات ذات الصلة مثل توضيح الآليات الجزيئية للإشارات TGF-β في جميع metazoans. أحد الاعتبارات الهامة في تصميم مثل هذه الشاشة هو من سلالة البداية. لقد أثبتنا أن كلا ERI-1؛ لين-15B وقوة الرد السريع 3-هي أكثر حساسية لتغذية رني من سلالات السيطرة، وهو ما يتسق مع الدراسات السابقة 12،13. ومع ذلك، على الرغم من ERI-L؛ لين-15B أظهرت أقوى النمط الظاهري، فإن الحيوانات لا ينمو بشكل جيد وأنتجت سلالة قليلة. وهكذا، في شاشة واسعة النطاق، ونحن لن يكون كافيا لتسجيل الحيوانات من الظواهر هذه السلالة. ونتيجة لذلك، نؤيد-3 سلالة قوة الرد السريع في تطبيقرني تقنية التغذية لتنظيم حجم الجسم. A الخيار الثاني للنظر في ما إذا كان الضغط البداية هي للشروع في مسار الشاشة مع DBL-1 أو سليمة لتبدأ سلالة توعية التي فيؤدى ذلك المسار DBL-1 أو فرط نشاط. هذه النقاط البديلة بدءا من المحتمل أن تؤدي إلى التعرف على التداخل ولكن مجموعات متميزة من مكونات الإشارة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل بروتوكول لدينا لدراسة الظواهر تال للمرحلة الجنينية الأخرى. في هذه الحالة، قد المرحلة من الحيوانات إلى أن للسجل النمط الظاهري في المصالح تحتاج إلى تعديل عن طريق تغيير مدة النمو في الخطوة 2.5. قبل الشروع في شاشة نطاق واسع لالظواهر الأخرى، فإننا نوصي شاشة التجريبية مع الجينات المعروفة لإنتاج النمط الظاهري من الأهمية مثل وصفنا هنا لDBL-1، SMA-2، سعد محمد سعد محمد-3-4، و-SMA 6.
باستخدام هذا البروتوكول، هدمت مكونات مسار DBL-1 أظهرت المتوقع النمط الظاهري طول الجسم. Tوكانت خرطوم الحيوانات رني عن 68-95٪ مقارنة مع طول في الحيوانات السيطرة. في الدراسات السابقة، DBL-1 فقدان المسار من المسوخ وظيفة الجينية في مرحلة البلوغ حوالي 50٪ أقل من الحيوانات البرية من نوع 7،10،11. ولذلك، فإن تقنية التغذية رني المقدمة هنا لا تقضي نهائيا على النشاط الجيني. وبالتالي، قد تكون محدودة الأسلوب في قدرتها على تحديد مكونات مسار التي تحتوي على النمط الظاهري ضعيفة. وفي الوقت نفسه، لأن هناك العديد من الجينات التي تنظم طول الجسم والجينات التي تم تحديدها من الشاشة قد لا تقع بالضرورة أيضا في مسار-1 DBL. يجب أن يتم تنفيذ مزيد من التجارب لوضع المرشحين في الممرات، كما هي الحال في أي طريقة أخرى الشاشة.
وخلاصة القول التغذية رني، وشاشات في C. وقد أثبتت ايليجانس مفيدة في تحديد الجينات المسؤولة عن عملية الفائدة. في هذا البروتوكول، ونحن الأمثل البروتوكولات القائمة لتكون فعالة للغاية في تحديد العيوب حجم الجسم. لا يمكن لبروتوكول الأمثل مزيدتعديل لدراسة الظواهر تال للمرحلة الجنينية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر جيمس كلارك لتقديم شخصيات من الحيوانات في مختلف نقاط زمنية التنموية. C. تم الحصول على سلالات ايليجانس في هذه الدراسة من مركز علم الوراثة Caenorhabditis، وهو مدعوم من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). وأيد هذا العمل من قبل 1817 من جامعة مدينة نيويورك CIRG لJL وCSD، والمعاهد الوطنية للصحة و1R15GM073678-01-01 1R15GM097692 لجنة التنمية المستدامة ونحن نشكر الدكتور ويليام J رايس، والدكتور ناتاليا هولتزمان، وسيلفستريني ميليسا للتعليقات على المخطوط. تم تنفيذ هذا العمل في التنفيذ الجزئي فقط من متطلبات للحصول على درجة الدكتوراه من مركز الدراسات العليا التابع لجامعة مدينة نيويورك (S. شيونغ).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M.
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C.
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
