Summary
我们演示了如何使用供给的RNAi技术敲除目标基因和分体尺寸型
Abstract
双链RNA介导的干扰（RNAi）是一种有效的策略，以击倒靶基因的表达1-3。它已被应用到许多模型系统，包括植物，无脊椎动物和脊椎动物。有各种各样的方法来实现RNAi 在体内 4,5。例如，可以与靶基因的RNAi载体转化，然后永久或瞬时转化的细胞系或初级细胞实现的基因敲除效果，或者从特定的靶基因（RNAi的寡核苷酸）的合成的双链寡核苷酸，可以是瞬时转化靶基因沉默的细胞系或原代细胞或合成的双链RNA分子可显微注射到生物体。由于线虫C.的利用细菌作为食物来源，饲养的动物与对靶基因的表达双链RNA的细菌提供了一个可行的策略。在这里，我们提出的RNAi输送机身尺寸表型的方法来得分。车身尺寸C.线虫主要受型TGF-β -等配位体DBL-1，所以该法是适合识别的TGF-β信号元件7。我们使用不同的菌株，其中包括两个RNA干扰过敏株重复供给的RNAi实验。我们的研究结果表明，RRF-3株给了我们最好的预期的RNAi表型。该方法易于操作，重现性好，易于量化。此外，我们的协议，最大限度地减少了使用专门的设备，所以它是适合于规模较小的实验室或主要是本科院校。
Protocol
1。准备携带目的基因序列的RNA干扰进料板
- 如果使用市售的RNAi库（ 例如，从源生物科学生命科学），继续执行步骤1.4。另外，克隆到载体L4440，一种常用的蠕虫RNAi质粒8的靶基因序列，通过标准的克隆协议。
- 变换的菌株HT115（DE3）中，用25μg/ ml的羧苄青霉素的LB琼脂平板上培养和12.5微克/毫升四环素的重组质粒转化，并挑选单个克隆，以备将来使用。
- 同时，转换到菌株HT115使用的实验作为对照的空载体L4440。
- 文化重组和空L4440携带的细菌在1毫升LB肉汤与100μg/ ml氨苄青霉素过夜，在37°C。四环素还没有添加由于事实，即它减小RNAi效率。
- 添加另一5毫升隔夜丘尔到100μg/ ml氨苄青霉素的LB肉汤重，另一个孵育4-6小时，在37°C。
- 种子0.5毫升重组或空L4440携带细菌培养到的RNAi蠕虫板。标记所有板与克隆名称。
- 马克板孵育过夜，在37℃至生长细菌草坪;这些的RNAi靶基因序列的带或不带板。至少有2块板应为每个条件制备。
2。文化蠕虫的RNAi送料板
- 火焰消毒，铂丝的尖端蠕虫挑。使用WORM挑来挑去6-10第四幼虫期（L4）雌雄同体每个RNA干扰板，重组或空L4440的动物将使用细菌作为食物来源。
- 让雌雄同体的增长，在20°C（一个标准的文化条件线虫 ）过夜，他们将成为年轻的成年人的第二天。
- 6-10青壮年转移到一个新的相应标记，并准备RNA干扰板。
- 让成人产卵4-6小时，然后取出所有的成年人板，这一步是同步的后代。一旦母亲被删除，开始计时。这是时间为零。
- 将培养板在20°C，让动物长到特定的发展阶段，在该协议中，我们选择了年轻的成年人表型分析。击倒在一个正常的速度发展，培养72小时是足够的动物成为年轻的成年人。然而，不同的基因影响动物的不同发展。如果RNAi技术使动物生长速度不同，年轻人可以被认定为不超过24小时过去L4完成外阴的发展和2-6胚胎在子宫内（育）。要确定其他发展阶段，研究人员应使用性腺及外阴的发展为导向。
3。分数车身尺寸表型的RNAi治疗的蠕虫
- 将两层颜色标签磁带在载玻片上。使两个本身载玻片上。然后，将一个新的载玻片上，在两者之间的幻灯片用胶带。熔体在水中的2％琼脂糖;应用一个下拉到中心的新的载玻片上，然后按下顶端的第二玻璃上滑动，使一层薄薄的2％琼脂糖如前所述9。
- 琼脂糖凝固后，取出顶部的载玻片上，，琼脂糖凝胶垫的幻灯片已经准备好加载蠕虫。标签幻灯片与克隆名字。
- 加入10微升25毫米NaN的3琼脂糖垫;选择30-40动物的NaN 3解决方案，以固定，然后把盖玻片的顶部，重复重组和空L4440携带的RNA干扰治疗的动物。
- 在解剖显微镜下的图像的蠕虫使用2.5倍的物镜，这里我们使用徕卡数码相机与支持软件Qcapture的，。
- 校准，第一次拍摄图像的标准千分尺尺。然后打开图像的Image-Pro软件中，点击“测量”，然后选择“校准”，然后选择“空间校准向导”。随着“校正活动图像”选中，单击“下一步”。输入的名称的校准和确保的空间参考单元被设置到微米。然后，检查“创建参考校准”按钮，然后单击“下一步”。点击“参考线”。会出现一个参考比例尺。重新放置比例尺的千分尺的端部相匹配，则表明参考表示1,000个单位。点击“确定”，“下一步”，“完成”。
- 一旦软件校准，打开一个蠕虫图像。然后，选择“测量”菜单下，选择“校准”，然后点击“选择空间”。在下拉菜单中，选择创建的文件名千分尺校准。然后，在“测量”菜单中，选择“测量”。在打开的窗口中，选择“自由绘制工具，并通过动物的身体，从头部到尾部与电脑鼠标（ 图1）的中心跟踪线。将在窗口的长度。现在你有两组数据：体长，治疗靶基因的RNAi和处理空L4440矢量的控制动物的动物。
- 导出到Microsoft Excel文件，或其他合适的统计软件的长度测量。的数据进行分析，通过计算每个样本的平均值和标准偏差。然后比较学生的t检验的样品。
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Representative Results
在我们的研究中，我们专注上机身尺寸调节的DBL-1/TGF-β途径。 DBL-1途径体型小，更短的车身长度相比，与野生型动物7,10,11功能的损失。因此，屏幕为C.线虫的机身尺寸突变体能够确定TGF-β信号组件和改性剂。 DBL-1信号是介导的一个保守的TGF-β的信号转导途径，其中包括细胞表面受体与细胞内的Smad信号传感器12。要测试的有效性的RNAi通过喂养的车身尺寸突变体的识别，我们使用了这种技术击倒DBL-1通路组件：dbl-1/ligand; SMA-2，SMA-3，sma-4/Smads，;的sma-6/receptor。我们的研究中，我们使用了两种不同的RNA干扰过敏C.的菌株进行实验：ERI-1 LIN-15B RRF-3和13,14。同时，我们也用N2（STAndard野生型）菌株和lin-36，LIN-15途径的RNA干扰的敏感性，但类似N2 13的一个组成部分。我们的研究结果显示（ 图2），所有这些菌株如预期，显示短机身尺寸型（P <0.001），SMA-6 RNAi在LIN-36的背景。 RRF-3的背景，年轻的成年人RNAi治疗后体长分别为84％〜95％单独的载体。在ERI-1的LIN-15B背景的年轻人，体长RNAi后的68〜86％，对照组动物。相比的lin-36和N2菌株，两者的RNAi过敏性菌株RRF-3和蓖麻-1;的lin-15b的更敏感。
图1。代表图像的动物身体长度的测量。A.测量前动物形象; 
图2。 DBL-1通路组件已通过RNAi喂养方法灭活动物的体长。RNA干扰动物，所有这些背景株中显示短的车身长度预期的表型（P <0.001），除SMA-6 RNAi在LIN-36背景。 RNAi的RRF-3和ERI-1-15B林株表现出了更强的表型的lin-36和N2背景。 
图3。原理图ðescription的，利用RNAi喂养策略，以筛选候选基因。
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Discussion
在这个协议中，我们描述的车身尺寸有缺陷的突变体C.识别方法通过RNA干扰喂养的线虫 。此方法是适用于TGF-β信号分量的识别。由于这样的组件通过进化15是高度保守的，这样的屏幕是在所有后生动物阐明的分子机制的TGF-β信号有关。在这样的屏幕设计是一个重要的考虑出发菌株。我们已经证明，无论ERI-1，LIN-15b和RRF-3更敏感的RNAi喂养比对照菌株，这与以往的研究12,13是一致的。然而，即使蓖麻-升;的lin-15b的表现出最强的表型，动物没有生长良好，并生产了少量的后代。因此，在一个大型的屏幕，我们不会有足够多的动物，得分从该菌株的表型。作为结果，我们主张RRF-3株申请RNA干扰喂养技术车身尺寸调节。考虑出发菌株的第二个选择是是否启动屏幕DBL-1通路完整或致敏株，其中DBL-1途径是妥协，或过度活跃的开始。这些可供选择的出发点都是可能导致的重叠，但不同的信号元件的识别。我们的协议也可以被修改，以研究其他胚后的表型。在这种情况下，感兴趣的表型的可得的动物的阶段，可能需要进行修改，通过改变在步骤2.5的增长的持续时间。启动其他表型的大型屏幕前，我们会建议试点屏幕产生兴趣的表型的基因，如我们在这里描述DBL-1，SMA-2，SMA-SMA-4和SMA- 6。
通过使用此协议，撞倒DBL-1通路元件表现出预期的体长型。 Ţ软管RNA干扰动物与对照组动物相比，长度约68-95％。在以前的研究中，DBL-1通路失去功能的基因突变在成年缩短约50％，比野生型动物7,10,11。因此，这里介绍的供给的RNAi技术并没有完全消除基因的活性。因此，该方法可以被限制在其能力，以确定有一个弱的表型的通路的组件。同时，由于有许多基因，调节人体的长度，从屏幕上的基因也可能不一定下降DBL-1途径。进一步的实验应进行候选人的途径，是真正的任何其他屏幕的方法。
总之，RNAi技术的喂养屏幕C.线虫已被证明可用于确定在感兴趣的过程中所涉及的基因。在这个协议中，我们优化了现有协议的机身尺寸为缺陷的识别是非常有效的。可以进一步优化的协议修改为其他胚后的表型的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢詹姆斯·C.克拉克为动物提供的数字，在不同的发育时间点。 的菌株在这项研究中获得的秀丽隐杆线虫的遗传学中心，这是由美国国立卫生研究院国家研究资源中心（NCRR）的支持。这项工作是从纽约市立大学支持的CIRG 1817 JL和惩教署和美国国立卫生研究院1R15GM073678-01和1R15GM097692-01，惩教署，我们感谢William水稻博士，博士娜塔莉亚·霍尔茨曼，梅丽莎Silvestrini的手稿上的评论。这项工作是进行在部分履行一个博士学位研究生中心纽约市立大学（S.雄）“的要求。
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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