Summary
We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype in
Abstract
Dubbelstrengs RNA-gemedieerde interferentie (RNAi) is een effectieve strategie om knock down doelwit genexpressie 1-3. Het is toegepast op vele modelsystemen zoals planten, invertebraten en vertebraten. Er zijn verschillende methoden om RNAi bereiken in vivo 4,5. Bijvoorbeeld, het doelwitgen kan worden omgezet in een RNAi vector, en vervolgens permanent of tijdelijk omgezet in cellijnen of primaire cellen gen knockdown effecten te bereiken, als alternatief gesynthetiseerde dubbelstrengs oligonucleotiden van specifieke doelgenen (RNAi oligos) kan tijdelijk worden omgezet in cellijnen of primaire cellen doelgenen zwijgen, of gesynthetiseerde dubbelstrengs RNA moleculen worden gemicroinjecteerd in een organisme. Aangezien de nematode C. elegans gebruikt bacteriën als een bron van voedsel, het voeden van de dieren met bacteriën die dubbel-strengs RNA tegen target genen biedt een levensvatbare strategie 6. Hier presenteren we een RNAi voedenmethode om lichaamsgrootte fenotype scoren. Lichaamsgrootte in C. elegans wordt primair gereguleerd door de TGF-β - zoals ligand DBL-1, zodat deze test is geschikt voor identificatie van TGF-β signaleringscomponenten 7. We verschillende stammen gebruikt, waaronder twee RNAi overgevoelig stammen aan de RNAi voeden experimenten te herhalen. Onze resultaten laten zien dat RRF-3 stam gaf ons de beste verwachte RNAi fenotype. De methode is eenvoudig uit te voeren, reproduceerbare en gemakkelijk gekwantificeerd. Verder is onze protocol minimaliseert het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, dus het is geschikt voor kleinere laboratoria of aan degenen met voornamelijk undergraduate instellingen.
Protocol
1. Het voorbereiden van RNAi voeden Platen uitvoeren Target gensequentie
- Bij gebruik van in de handel verkrijgbare RNAi bibliotheken (bijv. vanuit de Bron BioScience LifeSciences), ga dan verder met stap 1.4. U kunt ook klonen target-gen-sequenties in vector L4440, een veelgebruikte worm RNAi plasmide 8, door standaard klonen protocol.
- Transformeren het recombinant plasmide in bacteriële stam HT115 (DE3) kweken ervan op LB-agarplaten met 25 mg / ml carbenicilline en 12,5 pg / ml tetracycline en kies een enkele kloon voor toekomstig gebruik.
- Ondertussen transformeren de lege vector L4440 in bacteriële stam HT115 gebruikt als controle voor de experimenten.
- Cultuur zowel recombinant en lege L4440-dragende bacteriën in 1 ml LB-bouillon met 100 ug / ml ampicilline overnacht bij 37 ° C. Tetracycline is niet te wijten aan het feit dat het rendement af RNAi toegevoegd.
- Voeg een 5 ml LB-bouillon met 100 ug / ml ampicilline overnacht in de culture, incubeer een 4-6 uur bij 37 ° C.
- Zaad 0,5 ml recombinant of lege L4440-dragende bacteriecultuur op de RNAi worm platen. Label alle platen met kloon naam.
- Markeer de platen en incubeer overnacht bij 37 ° C tot bacteriedek groeien, zijn de RNAi platen met of zonder doelgen sequentie. Minstens 2 platen moeten worden voorbereid voor elke conditie.
2. Cultuur Worms op de RNAi Feeding Platen
- Flame steriliseren de punt van een platina draad worm keuze. Gebruik de worm pakken op te halen zes-tien vierde larvestadium is gekomen (L4) hermafrodieten aan elk RNAi plaat die ofwel recombinant of lege L4440 bevat; zullen de dieren de bacterie te gebruiken als een bron van voedsel.
- Laat hermafrodieten groeien bij 20 ° C (standaard kweekomstandigheid voor C. elegans) nacht, zullen ze jongvolwassenen de volgende dag.
- Overdracht 6 tot 10 jonge volwassenen in een nieuwe navenant gelabeld en bereid RNAi plaat.
- Laat devolwassenen leggen eieren voor 4-6 uur, en verwijder vervolgens alle volwassenen van de plaat, deze stap is het synchroniseren van de nakomelingen. Zodra de moeders worden verwijderd, start de tijd te tellen. Dit tijdstip nul.
- Incubeer de platen bij 20 ° C te laten dieren groeien op specifieke ontwikkelingsfase, in dit protocol, kiezen we jonge volwassenen voor fenotypische analyse. Voor knockdowns die zich ontwikkelen in een normaal tempo, 72 uur incubatie is voldoende voor dieren te worden jonge volwassenen. Echter, verschillende genen beïnvloeden dierlijke ontwikkeling anders. Als RNAi veroorzaakt dieren om te groeien in een ander tempo, kunnen jonge volwassenen worden geïdentificeerd als die niet meer dan 24 uur voorbij L4 met afgerond vulva ontwikkeling en 2-6 embryo's in de baarmoeder (indien vruchtbaar). Om andere ontwikkelingsstadia te identificeren, moet de onderzoeker gonadale en vulva ontwikkeling gebruiken als een gids.
3. Score Lichaam Grootte fenotypen van RNAi behandeld Worms
- Worden twee lagen gekleurde label tapes op een glasplaatje. Maak twee van dese glazen dia's. Dan, plaats een nieuw glasplaatje in tussen de twee dia's met tape. Smelt 2% agarose in water, een druppel naar het centrum van de nieuwe glasplaatje, vandaar de tweede glaasje druk op de top van een dunne laag van 2% agarose zoals eerder beschreven negen maken.
- Zodra agarose is gestold, verwijder de bovenste glasplaatje, de dia met agarose pad is klaar om wormen te laden. Label dia met kloon naam.
- Voeg 10 ul 25 mM NaN 3 om de agarose pad; halen 30 tot 40 dieren in het NaN 3 oplossing om ze te immobiliseren, dan dekglaasje op de top; herhaling voor zowel recombinant en lege L4440-dragende RNAi-behandelde dieren.
- Afbeelding van de wormen onder dissectiemicroscoop met 2.5x objectief, hier hebben we Leica digitale camera met ondersteunende software Qcapture.
- Voor het kalibreren, eerst een opname van een standaard micrometer heerser. Vervolgens opent u de afbeelding in Image-Pro software, klik op "maatregel" en kies "kalibratie" en kies"Ruimtelijke kalibratie wizard". Met "het kalibreren van de actieve afbeelding" geselecteerd, klikt u op "volgende". Voer de naam voor de kalibratie en ervoor te zorgen dat de ruimtelijke referentie-eenheden zijn ingesteld op micrometer. Controleer vervolgens de "een verwijzing kalibratie" knop en klik op "volgende". Klik op "draw referentielijn." Een verwijzing schaal balk verschijnt. Plaats de schaalbalk aan de uiteinden van de micrometer overeenkomen, dan blijkt dat de verwijzing 1.000 eenheden aangeeft. Klik op "OK", "Volgende" en "Voltooien".
- Zodra de software is gekalibreerd, opent een worm beeld. Selecteer vervolgens onder de "maatregel" menu, selecteer "kalibratie" en klik vervolgens op "select ruimtelijke". In het pull down menu, selecteer de bestandsnaam gemaakt voor de micrometer kalibratie. Vervolgens onder de "maatregel" menu, selecteer "metingen." In het venster dat opent, selecteert u de gratis-draw tool en trek een lijn door het midden van het dierlijk lichaam van kop tot staart met computermuis (figuur 1). De lengte zal worden gerapporteerd in het venster. Nuje hebt twee groepen gegevens: lichaamslengte van dieren die zijn behandeld met target-gen RNAi en controle dieren behandeld met lege L4440 vector.
- Exporteer de lengte metingen naar een Microsoft Excel-bestand, of een andere geschikte statistische software. Analyseren van de gegevens door het berekenen van het gemiddelde en standaardafwijking voor elk monster. Vergelijk monsters met Student's t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In ons onderzoek richten we ons op de lichaamsgrootte regulering door de DBL-1/TGF-β pad. Het verlies van functie van de DBL-1-route resulteert in kleine lichaamsgewicht, met een kortere lengte vergeleken met wild-type dieren 7,10,11. Zo schermen voor C. elegans lichaamsgrootte mutanten kunnen identificeren TGF-β signalering componenten en modificatoren. DBL-1-signalering wordt gemedieerd door een geconserveerd TGF-β signaaltransductieroute die celoppervlak receptoren en intracellulaire Smad signaal transducers 12 omvat. Om de effectiviteit van RNAi te testen door het voeren voor de identificatie van lichaamsgrootte mutanten, gebruikten we deze techniek af te breken DBL-1-route componenten: dbl-1/ligand; sma-2, sma-3, sma-4/Smads, en sma-6/receptor. Voor ons onderzoek gebruiken we twee verschillende RNAi overgevoelig C. elegans stammen om het experiment uit te voeren: ERI-1; lin-15b en RRF-3 13,14. Ondertussen hebben we ook gebruikt N2 (standard wild-type) stam en lin-36, een component in de lin-15 route waarvan RNAi gevoeligheid is echter vergelijkbaar met N2 13. Onze resultaten (Figuur 2) tonen aan dat al deze stammen korte lichaamslengte fenotype weergegeven zoals verwacht (p <0,001), behalve sma-6 RNAi in lin-36 achtergrond. In RRF-3 achtergrond, lichaam lengte van de jonge volwassenen na RNAi behandeling waren 84 ~ 95% van de vector alleen. In ERI-1, lin-15b achtergrond, lichaam lengte van jongvolwassenen na RNAi respectievelijk 68 ~ 86% van de controle dieren. Vergeleken met lin-36 en N2 stammen, zowel de RNAi overgevoelige stammen SRF-3 en ERI-1, lin-15b waren gevoeliger.
Figuur 1. Afbeeldingen slechts ter illustratie van dierlijk lichaam lengte wordt gemeten A. dier beeld voor de meting.;
Figuur 2. Lengte van dieren waarin DBL-1-route componenten zijn geïnactiveerd door RNAi voedermethode. RNAi dieren al deze achtergrond stammen getoonde korte lichaamslengte fenotype zoals verwacht (p <0,001), behalve sma-6 RNAi in lin-36 achtergrond. RNAi van RRF-3 en ERI-1, lin-15b stammen vertoonde een sterkere fenotype dan lin-36 en N2 achtergrond.
Figuur 3. Schematische deschrijving van het gebruik van RNAi voerstrategie te screenen voor kandidaat-genen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we onze methode voor de identificatie van lichaamsgrootte defectieve mutanten van C. elegans door RNAi voeden. Deze methode is van toepassing op de identificatie van TGF-β uitschakeling. Aangezien dergelijke onderdelen worden geconserveerd door evolutie 15, zoals schermen relevant zijn voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van TGF-β signalering in alle metazoa. Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een dergelijk scherm is de uitgangsstam. We hebben aangetoond dat zowel ERI-1, lin-15b en SRF-3 zijn gevoeliger voor RNAi feeding dan de controlestammen, hetgeen consistent is met eerdere studies 12,13. Echter, hoewel ERI-l; lin-15b toonde de sterkste fenotype, heeft de dieren niet goed groeien en produceerde enkele nakomelingen. Zo is in een grootschalig scherm, dan zouden we niet genoeg dieren voor het scoren van fenotypes van deze stam. Daardoor gaat onze voorkeur uit de SRF-3 stam van de toepassingRNAi voeden techniek om lichaamsgrootte regelgeving. Een tweede keuze om te overwegen in de beginnende stam is of om een scherm te starten met de DBL-1-route intact of om te beginnen met een gevoelig stam waarin het DBL-1-route ofwel in het gedrang komt of overactief. Deze alternatieve uitgangspunten zullen waarschijnlijk leiden tot de identificatie van overlappende maar verschillende sets uitschakeling. Onze protocol kan worden aangepast aan de studie van andere postembryonic fenotypen. In dit geval kan de fase van de dieren te scoren voor het fenotype van belang moeten worden gewijzigd door wijziging van de duur van de groei in stap 2.5. Voorafgaand aan de start van een grootschalig scherm voor andere fenotypes, zouden we een pilot-scherm raden met genen waarvan bekend is dat het fenotype van belang te produceren, zoals we hier beschrijven voor dbl-1, sma-2, sma-3 sma-4, en sma- 6.
Door het gebruik van dit protocol, slopen DBL-1-route componenten toonde verwachte lichaamslengte fenotype. Tslang RNAi dieren waren ongeveer 68 tot 95% in lengte in vergelijking met controle dieren. In eerdere studies, DBL-1-route verlies van functie genetische mutanten in de volwassenheid zijn ongeveer 50% korter dan wild-type dieren 7,10,11. Daarom heeft de RNAi feeding techniek hier wordt gepresenteerd niet volledig te elimineren genactiviteit. Aldus kan de werkwijze worden beperkt in de mogelijkheid om weg componenten die een zwakke fenotype te identificeren. Ondertussen, aangezien er vele genen die lengte te reguleren, genen geïdentificeerd uit het scherm misschien ook niet per se vallen in DBL-1-route. Verdere experimenten moeten worden uitgevoerd om de kandidaten te plaatsen in de wegen, zoals geldt voor een ander scherm methode.
Samengevat RNAi voeden schermen in C. elegans nuttig zijn gebleken bij het identificeren van genen betrokken bij een proces plaats. In dit protocol hebben we geoptimaliseerd bestaande protocollen die zeer effectief bij de identificatie van lichaamsgrootte defecten. De geoptimaliseerde protocol kan verder wordenaangepast voor de studie van andere postembryonic fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken James Clark voor het verstrekken van gegevens van dieren bij verschillende ontwikkelingsstadia tijdstippen. C. elegans stammen in deze studie werden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center, die wordt ondersteund door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dit werk werd ondersteund door CIRG 1817 van CUNY naar JL en CSD, en door NIH 1R15GM073678-01 en 1R15GM097692-01 tot CSD Wij danken dr. William J Rice, Dr Nathalia Holtzman, en Melissa Silvestrini voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd uitgevoerd in gedeeltelijke vervulling van de vereisten voor een PhD-graad van de Graduate Center van de City University van New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
References
- Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
- Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
- Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
- Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Savage-Dunn, C., et al. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans. Development. 129, 4989-4998 (2002).
- Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
- Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
- Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).
