Summary
有越来越多的证据，即缺血预处理（PC） - 非伤害性脑缺血大脑的挑战 - 赋予随后破坏性的缺血性损伤的瞬态保护。我们建立双侧颈总动脉闭塞（夹闭双侧颈总动脉）作为预处理刺激诱导早期缺血耐受（IT）C57BL6 / J小鼠局灶性脑缺血（大脑中动脉闭塞，缺血引起的）。
Abstract
有越来越多的证据，即缺血预处理 - 非伤害性脑缺血大脑的挑战 - 赋予随后破坏性的缺血性损伤的瞬态保护。我们已经建立了双侧颈总动脉闭塞C57BL6 / J小鼠局灶性脑缺血预处理刺激诱发早期缺血耐受。在这段视频中，我们将展示这项研究使用的方法。
Introduction
缺血性中风是一种疾病，死亡率高和一个巨大的社会经济负担1。尽管密集的实验和临床科学纵观近十年的努力，急性缺血性脑卒中患者的治疗选择仍然非常有限2。在对比的是，在发达国家，老年人的比例的增加将显着增加缺血性中风患者的发病率和患病率与未来几十年中3。因此，迫切需要新的治疗策略与缺血性中风患者。
一种方法是应对破坏性刺激大脑内源性适应机制，以获得进一步的了解。这种脑源性的神经保护作用也被称为缺血预处理（PC）或脑缺血耐受（IT），并描述了一种现象，其中施加到大脑的非破坏性的伤害性刺激，诱导瞬态电阻对后续的损害缺血性损伤4。 IT发生在两个不同的时间窗口：早期的IT分钟到几个小时后，PC内发生延迟，这需要一个延迟了几个小时，发生4。
到目前为止，一直专注于IT研究脑延迟IT。少得多称为早期IT的机制。这项研究的目的是建立双侧颈总动脉闭塞（夹闭双侧颈总动脉），这是一个既定的刺激诱导延迟IT，作为充足PC刺激诱导早期局灶性脑缺血（大脑中动脉闭塞引起的缺血） C57BL6 / J小鼠。
在这两个手术（夹闭双侧颈总动脉缺血），通过激光多普勒血流仪（LDF）监测脑血流（CBF）进行。
夹闭双侧颈总动脉进行了在麻醉和自主呼吸小鼠。暴露双侧颈总动脉（CCA）和闭塞，持续60秒，然后通过5分钟的再灌注。此夹闭双侧颈总动脉/再灌注序列重复两次。手术后，老鼠恢复得很快，没有任何迹象表明，功能障碍。为了排除，夹闭双侧颈总动脉上述协议并未导致延迟在脑细胞的死亡，我们在执行一个TDT介导的dUTP-生物素缺口末端标记法（TUNEL）染色72小时后，夹闭双侧颈总动脉（或假手术）独立成团。
缺血诱导局灶性脑缺血啮齿动物5-7是一个广泛建立的模型。手术进行了使用标准化作业程序（SOP）8。曝光后的左CCA，硅覆盖的单丝引入的前端CCA，先进到Willis环通过内颈动脉（ICA），直到大脑前动脉（ACA），从而，中脑动脉的起源（ MCA）闭塞定义的一段时间。在这项研究中，我们用45分钟的缺血，这通常会导致的缺血性病变在马华境内涉及纹状体和大脑皮质区。
在我们的研究中，我们分析了早期使用夹闭双侧颈总动脉作为PC刺激时空的档案。我们的数据表明，夹闭双侧颈总动脉缺血的最佳时间之间的延迟引发早期的IT是30分钟。
在这段视频中，我们将给予两个外科手术， 即夹闭双侧颈总动脉缺血的示范。
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Protocol
按照献给Landesamt Gesundheit和Soziales，柏林，德国的准则和法规，在这篇文章中描述的所有程序进行。
手术前的程序
1。单丝的制备
- 腔内长丝的制备，用8-0尼龙单丝缝合线，被切成每个长度为13mm。
- 对于涂布的单丝，粘膜，Xantopren中号（贺利氏古莎公司，德国Hanau）使用激活的活化剂溶液（活化剂，通用加Heraeus公司姆古莎GmbH公司，旅游Hanau，德国）中加入一滴。
- 慢慢地拉过硅氧烷的单丝，直到它被完全覆盖着它。通过这样做，单丝均匀的硅胶覆盖。避免等待太久因为激活的涂层材料将迅速成为坚定和干。
- 前在硅胶开始凝固，它是建议剥离过度硅氧烷，拉放在一张纸，从灯丝。通过这样做，可以减薄硅层的近似厚度为200μm。
- 该基地的有机硅覆盖的单丝刺入橡皮泥，为了让它干通宵。
评论：在理想的情况下，只有灭菌或消毒的单丝应至少使用，以确保在手术部位的无菌性。在实践中，灭菌或消毒的手工制作的单丝单丝的质量是非常困难的，因为可能会恶化9。因此，它可能是可取的，而不是使用市售的无菌单丝。
2。准备手术器械及动物
- 所有手术器械保持在70％的乙醇。此外，每一个新的外科手术前，所有的手术器械进行了仔细清洗次用70％乙醇消毒。
- 手术部位彻底消毒，用70％的乙醇在所有的动物横断前。消毒站点被允许完全干透，再进行切口。没有进行附加的裁剪的皮草，因为这可能会导致微打磨和随后的皮肤炎症9。
外科手术
3。 LDF探头定位和LDF监测
- 麻醉诱导小鼠暴露于30％氧气，70％N 2 O，2.5％异氟醚使用的蒸发器的气体混合物组成的。维持麻醉，异氟醚的浓度降低至1.5％。小鼠的自主呼吸，通过在整个手术过程中的呼吸面罩。
- 插入直肠温度探头和固定小鼠，露出顶叶头的立体框架。在手术过程中，老鼠被放在一个恒温器控制加热垫，确保了核心温度恒定为37.0±0.5°C。矢状中线切口（〜1厘米长）进行顶叶颅骨暴露。
- 头骨的左侧进行了仔细的解剖和一个光纤探头直接固定到颅骨2毫米尾鳍和5毫米的横向前囟使用瞬间胶。之后，伤口边缘都经过精心改编，以避免脑低温以及感染。
- 鼠标转身露出颈部腹侧。光纤探头连接通过连接探头适配器（Perimed主探头418-1耶尔费拉，瑞典）的的LDF设备（Perimed的PeriFlux系统5000耶尔费拉，瑞典）。
评论：光纤探头转动鼠标时左右，应小心弯曲，以避免它打破了从头骨。
- LDF设备连接到一台笔记本电脑COM计算机。 LDF值连续拍摄发起使用PeriSoft为Windows（版本2.50，耶尔费拉，瑞典）， 图1演示的平均CBF当然，获得的从十个LDF录音期间夹闭双侧颈总动脉灌注。
4。双侧颈总动脉闭塞
- 麻醉维持3.1中所描述的。鼠标放置在它的后面。动物的尾巴和爪子，用胶带固定在加热垫。矢状腹正中切口（〜1cm的长度）。
- 两个涎腺仔细分离和动员起来，以可视化的底层CCA的。
- 两个CCA的仔细分离从各自的迷走神经及伴行静脉，不损害这些结构。迷走神经的操作可能会导致短暂或永久性的功能障碍的副交感神经系统，这有可能发生显着的心脏ARRhythmia甚至是不可逆的心脏骤停。因此，至关重要的是，以避免任何操纵的迷走神经。围绕每个CCA松动5-0丝线缝合循环。
- 一个小的硅管（直径2毫米），插入在CCA和丝线，每边之间。这种管子作为一个夹板的CCA的使用，以避免损伤动脉壁的缝线收紧（ 图4）。
- 两个CCA闭塞收紧丝线一分钟。只有老鼠LDF信号减少到<10％的基线信号，其中包括在研究中。双方CCA的重新开放后，五分钟再灌注期间启动。 LDF一个完整的再灌注保证。再灌注不全的动物（ 即 <90％恢复脑血流量相比，基线CBF），被排除在外。夹闭双侧颈总动脉一分钟和5分钟的再灌注的顺序重复两次，总的夹闭双侧颈总动脉durati上3分钟。 图1示出的平均CBF当然，10 LDF录音在BCCAO再灌注过程中获得的。在实验过程中，建议保持颈部创面用生理盐水湿。
- 最后再灌注后，除去所有的管道或缝合线，以及连接到头骨的光纤探头，缝合伤口，并根据需要为利多卡因软膏（Xylocain 2％;阿斯利康GmbH公司，威德尔德国），反复施加到伤口止痛管理。
- 小鼠被转移到预先加热（30℃）回收箱（MediHEAT. PecoServives有限公司布拉夫英国坎布里亚郡），直到他们重新获得完整的意识。此后，的小鼠被送回他们的动物笼舍。
5。大脑中动脉闭塞
- 小鼠重新麻醉，直肠温度探头插入小鼠放置在加热垫的脖子，露出腹侧。后来，他们瓦特东铁支线固定夹闭双侧颈总动脉一节中所描述的。
- 一个永久使用长7-0丝线缝合结扎周围的左CCA近端和螺纹尾端轻轻拉，用蚊式钳（ 图4）。
- 另一个永久结扎了周围的左外颈动脉（ECA）和该线程被被拉向动物的右侧（ 图4）。
- 周围的结缔组织左ICA认真动员和舌下神经轻轻地把的远端过程中ICA得到一个很好的概述。的左侧ICA弯曲到左侧翼腭动脉（PPA），而如下的基ICA的过程中的右侧（ 图4）。
评论：还有另外一个被识别的转向尾方向中的右侧的动脉。这是枕动脉，无论是从CCA分叉或从公关可变起源的ECA的oximal的一部分（ 图4）。
- 一个松散的缝合环周围的近端ICA，用5-0丝线。
- 使用一个小的血管钳，ICA暂时闭塞远端5-0松散的缝合环（ 图4）。
- 一个小切口，在远端的一部分CCA之前CCA分叉使用微血管剪刀（ 图4）。
- 预选的硅氧烷覆盖的单丝是通过小切口，引入到CCA的ICA推入，直到它停在微血管钳（ 图4）。
- 小心除去微夹钳从ICA，而单 丝被推进了深入的ICA，直到它停止（ 图4）。点评：在这一点上，翻转钳在左手，这样你就不会持有它像一支钢笔。这将有助于更容易抢灯丝与镊子。血管钳涂药，应在右手举行。这可能是必要的，为了防止出血从切口侧近紧固松动5-0缝合线周围的ICA。
- 单丝尖端的确切位置被确定，以检查它是否被推进到ICA和不进PPA。如果单丝尖端引入近端PPA，灯丝被轻轻拉回刚刚之前的ICA / PPA分岔。有人试图再次推进到ICA的单丝，同时轻轻拉出的基ICA的位向右侧。通过这样做，ICA远端的自然过程模拟使其更容易访问的ICA。
- 单丝后提前到ICA几乎完全收紧，松5-0缝线环周围的近端ICA为了保持地方灯丝。之后，所有的丝线被缩短，皮肤伤口缝合。
- 在手术过程中的流体损失补货ished注入1.0毫升生理盐水IP之后，被转移到鼠标预热回收箱，直到它重新获得完整的意识。
- 再灌注，老鼠再麻醉后取出仔细松开5-0丝线缝合周围的近端ICA和单丝。此后，缝合5-0再次收紧仔细，以防止出血。
- 确认彻底止血后，脖子上的伤口缝合。
- 反复涂抹利多卡因软膏局部皮肤需要缓解疼痛和鼠标被转移到预先加热（30℃）的回收箱，直到它重新获得完整的意识。
- 作为第一个成功的提示缺血过程，顺时针盘旋的动物进行了观察。修改小鼠10使用贝德森的得分功能缺损的严重程度进行了量化。据此改性贝德森得分，神经功能评分重新分级如下：0（运动功能正常），1（当鼠标的尾巴抬起躯干前屈和对侧前肢），2（盘旋对侧的一个平坦的表面上时，鼠标的尾巴举行，但正常在休息的姿势），3（扶着到对侧休息），4（无自发运动活动或死）。
6。假手术夹闭双侧颈总动脉
对于夹闭双侧颈总动脉假手续，小鼠被麻醉的持续时间一个真正夹闭双侧颈总动脉PC程序，流涎腺体进行了动员和CCA的暴露。至关重要的是，假手术组颈动脉或迷走神经的直接操作过程中避免。的CCA的操作可能会损坏的内皮细胞层，这可能会导致从血管内皮细胞或诱导局部血栓形成，动脉管腔内的血管活性化合物的释放。因此，假手术后可能发生的血栓栓塞事件。这将是一个重大的混杂因素THE工作步骤。另一方面，迷走神经的操纵可能导致暂时或永久的功能障碍的副交感神经系统，该系统具有显着的心律失常的发生甚至是不可逆的心脏骤停的潜力。因此，这是至关重要的，以避免任何操纵夹闭双侧颈总动脉的迷走神经。
手术后的程序
7。梗死体积测量
评估心肌梗死面积，缺血小鼠存活72小时后。后来动物深度麻醉，大脑被拆除，甲基丁快速冷冻，切片和染色梗死体积测量与苏木（使用Papanicolau协议）。脑切片在600微米间隔和脑梗死体积收集，确定使用图像分析仪（MCID核心7.0顺畅不间断，GE医疗集团尼亚加拉公司），并根据Lin 等人的方法，校正水肿。7,11
8。入选标准
我们只包括三个夹闭双侧颈总动脉发作期间有一个LDF测量脑血流量减少90％以上的动物。理想的情况下，LDF监测应在两个脑半球在夹闭双侧颈总动脉。实用性，进行仅在左右半球，这将在稍后进行MCAO LDF监测。这种方法已经被描述过6,12。再灌注后，每个夹闭双侧颈总动脉情节必须是完整的（ 即恢复到基线值）。持续老鼠被安放在麻醉状态下的时间缩短的原因，我们没有监控CBF在缺血手术。我们用一组独立的动物，然而，在试点研究监测CBF LDF在缺血手术。在这组老鼠中，我们一贯测量脑血流量减少90％，相比前基线CCA闭塞。此外，单丝CBF除去后恢复至> 90％的各CCA闭塞后的基准值。这些的LDF标准建立在一致的梗死卷7文学和结果。我们只包括动物其中有一个贝德森的得分至少1缺血后从麻醉恢复后。此外，只有动物缺血和存活72小时后显示没有颅内出血的迹象，包括在研究中。
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Representative Results
我们夹闭双侧颈总动脉协议导致的直接和深远的（> 90％）的脑血流减少时都CCA闭塞（ 图1）。重启CCA导致灌注完成，LDF（ 图1）监测。 PC，动物后没有任何迹象表明功能残疾。此外，无死亡病例。 TUNEL染色一组独立的动物进行了72小时后，夹闭双侧颈总动脉夹闭双侧颈总动脉（数据未显示）后，大脑中没有任何迹象表明，迟发性细胞死亡。
当分析夹闭双侧颈总动脉缺血的最佳时间之间的延迟时间的档案早（ 图2），我们发现了一个显着减少梗死体积（减少了65％，N = 10）相比，假手术组（N = 10）当进行夹闭双侧颈总动脉缺血前30分钟。此外，梗死体积减少时，夹闭双侧颈总动脉缺血组（n = 10）进行前2小时和24小时。 24小时为6秒（延迟）的时间窗口。 >
因此，可以得出结论，早期IT使用作为PC夹闭双侧颈总动脉的刺激的最佳时间窗口是局灶性脑缺血（MCAO）诱导前30分钟。
图1。病程平均CBF LDF测量值在夹闭双侧颈总动脉和再灌注组（n = 10）。
图2。不同的时间延迟N = 10/group夹闭双侧颈总动脉缺血后脑梗死体积时空的档案，图表显示平均值±标准差，* P <0,05假，** P <0.01（单因素方差分析与假邦费罗尼的事后检验）。
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图3。代表苏木素染色的脑切片来自BCCAO预处理（A）和假手术动物（B），其中缺血45分钟，30分钟后，夹闭双侧颈总动脉/假。大脑被取出和处理后72小时缺血。
图4。左颈动脉的血管解剖包括夹闭双侧颈总动脉和MCAO执行的程序的计划。
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Discussion
在我们的研究中，我们已经表明，三个序列夹闭双侧颈总动脉，每次持续一分钟，随后再灌注五分钟，是一个足够的缺血PC刺激诱导早期的IT。
此外，我们已经证明，使用预处理协议是一个安全和未成年人的侵入性手术没有值得注意的术后并发症发生率，没有迹象表明在脑细胞凋亡和无死亡。先前6-7,12已经描述了几种不同的预处理协议。其他已经使用了6分钟夹闭双侧颈总动脉作为预处理刺激13-14。然而，由于这样的事实，一分钟的夹闭双侧颈总动脉三次导致的IT在早期的时间没有任何可检测到的缺血性脑损伤的保护效果，我们决定使用该协议。
对于一致的结果，麻醉和手术过程的持续时间以及其他变量，如动物的重量，大脑温度在手术过程中，术后补液，术后疼痛管理，以及前和术后笼富集应该是标准化的15。特别注意整个完整的常温条件下的小鼠麻醉期间需要维护，因为低温本身具有预处理的效果，因此可以干扰夹闭双侧颈总动脉的影响16。在清醒及可自由移动的啮齿动物中，核心温度分别约为0.5和1之间度高于相应的脑温度17。休息时大脑清醒，可自由移动的啮齿动物的温度是约36.5 18摄氏度。由于我们没有测量大脑温度在我们的实验中，我们调整了小鼠的核心温度为37.0±0.5摄氏度实现类似上述的休息大脑温度的大脑温度。
从理论上说，使用挥发性麻醉药自可以是一个额外的混杂因素，因为它已被证明，异氟醚本身可诱导IT。然而，异氟醚麻醉成为有关PC的刺激，只有当重复给药几个小时，这是不是所描述的程序的情况下，在目前的研究19-21。此外，我们还分析了假手术动物来控制潜在的混杂的异氟醚麻醉效果。
用于缺血诱导的单丝的尺寸和形状起着关键的作用。硅均匀覆盖的细丝缺血，提高手术成功率，减少并发症，如蛛网膜下腔出血的速率，因此应首选相比，加热迟钝丝22。另一个关键点是灯丝长度。最佳纤维长度在9-11毫米之间，报告15。由于这样的事实，我们的切口近端CCA分叉中，我们使用的单丝的leng个13毫米，厚度约200微米。
两者合计，单丝的涂层，其长度的类型和质量是至关重要的，以确保有足够的MCA闭塞和通过前交通动脉，以避免显着的横流。大幅横流从右侧的圆的威利斯导致不必要的减少梗死体积，从而增加了可变性的结果23。的意图，以进一步降低结果的可变性的附加的程序标准化包括LDF-CBF监测在缺血期间和再灌注和使用市售的工业，标准化的单丝。通过使用市售的单丝，也可以确保无菌性。
此外，动物不具有> 90％CBF减少夹闭双侧颈总动脉或缺血期间，或不具有> 90％再灌注损伤的动脉重新开放后寿LD被排除在研究之外。这种做法将有助于进一步减少梗死体积，这主要发生在脑侧支循环的结果，常见的变种变异。
综上所述，夹闭双侧颈总动脉是建立和易于适用的模式，探讨在早期和延迟时间窗的效果吧。学习IT的现象，有助于获得更好的理解在大脑中的内源性保护机制。的角度来看，这可能有助于开发替代治疗急性缺血性中风患者的机会。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | SteREO CL 1500 ECO | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | David Kopf | Model 930 | |
| Scissors | FST | 91460-11 | |
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Mircovascular clamp | FST | 00398-02 | |
| Clamp applicator | FST | 00072-14 | |
| Springscissors | FST | 15372-62 | |
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| Needles | Feuerstein, Suprama | BER 562-20 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama |
References
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