Summary
Hier beschrijven we hoe u de fase van het murine reproductieve (pro-oestrus, oestrus, metestrus of diestrus) door een eenvoudige, niet-invasieve verzamelen en cytologische beoordeling van de vaginale uitstrijkjes te identificeren. Verder hebben we beschrijven hoe vaginale cytologie weerspiegelt circulerende hormoonspiegels ten grondslag liggen aan de transitie door de murine voortplantingscyclus.
Abstract
Een snelle methode beoordelen voortplantingsstatus in knaagdieren is niet alleen nuttig in de studie van reproductieve dysfunctie, maar is ook vereist voor de productie van nieuwe muismodellen van de ziekte en onderzoek naar de hormonale regulatie van weefselafbraak (of regeneratie) na challenge pathologische. De muizen reproductieve (of oestrische) cyclus is verdeeld in 4 fasen: pro-oestrus, oestrus, metestrus, en diestrus. Gedefinieerd schommelingen in bloedspiegels van de ovariële steroïden 17-β-oestradiol en progesteron, luteïniserend de gonadotropines en follikel stimulerend hormonen en luteotropic prolactine signaalovergang door deze reproductieve fasen. Veranderingen in cel typologie binnen de murine vaginale kanaal weerspiegelen deze onderliggende endocriene gebeurtenissen. Dagelijkse beoordeling van de relatieve verhouding van kernhoudende epitheelcellen, verhoornde squameuze epitheelcellen en leukocyten in vaginale uitstrijkjes kan worden gebruikt om muizen oestrische identificerenstadia. De mate van invasiviteit echter werkzaam in het verzamelen van deze monsters kunnen reproductieve status veranderen en ontlokken een ontstekingsreactie die cytologische beoordeling van uitstrijkjes kunnen verwarren. Hier beschrijven we een eenvoudige, niet-invasieve protocol dat gebruikt kan worden om de fase van de loopsheid van een vrouwelijke muis te bepalen zonder dat haar voortplantingscyclus. We detail hoe onderscheid te maken tussen de vier stadia van de oestrische cyclus van verzameling en analyse van de overheersende cel typologie in vaginale uitstrijkjes en laten we zien hoe deze veranderingen kunnen worden geïnterpreteerd met betrekking tot endocriene status.
Protocol
1. Voorbereiden Reagentia
- Voor steriele vaginale lavage, autoclaaf dubbel gedestilleerd water (ddH 2 O) en bewaren in een goed afgesloten container bij kamertemperatuur totdat het nodig is.
- Voor cytologisch onderzoek, voeg 0,1 g kristal violet poeder aan 100 ml ddH 2 O. Meng goed. Kristalviolet kleurstof (0,1%) worden opgeslagen in een hermetisch afgesloten verpakking bij kamertemperatuur totdat het nodig is.
2. Het verzamelen van vaginale cellen (vaginale lavage)
- Plaats een latex bol op het einde van een steriele 200 ul tip en stelt ongeveer 100 ul steriel ddH 2 O met de gradaties van de tip als een leidraad volume.
- Til de muis uit haar kooi en plaats ze op de kooi hopper (deksel) met haar achterpoten / achterkant naar u toe.
- Stevig vastpakken van de staart en verheffen de achterzijde. De muis zal nu alleen haar voorpoten grijpen de trechter. Op dit punt van de muis kan plassen. Zo ja, Wacht tot urineren stopt. Indien er urine links bij de ingang van het vaginale kanaal, kunt u de opening met een overmaat ddH 2 O met behulp van een aparte tip (dat wil zeggen, niet uw monstername tip) spoelen.
- Plaats het uiteinde van de ddH 2 O gevulde tip bij de opening van de vagina zorg dat de opening niet doordringen vaginale (en cervicale) stimulatie schijndracht induceren in ratten 1,2. Recente rapporten suggereren muizen minder gevoelig hiertoe echter zorg moeten worden genomen om de mate van invasiviteit in herhaalde analyses 3 minimaliseren.
- Zachtjes druk de lamp een kwart verdrijven de helft van de hoeveelheid water (~ 25-50 pl) bij de opening van vaginale kanaal. De vloeistof zal spontaan te zuigen in het kanaal zonder punt inbrengen. Langzaam laat de druk op de lamp. De vloeistof zal terug trekken in de punt. Vermijd het vrijgeven van de druk te snel om aspiratie van vloeistof te voorkomenin de lamp. Een tip gefiltreerd kunnen nuttig zijn voor dit doel.
- Herhaal de vorige stap 4-5 keer met dezelfde tip, bol en vloeistof een voldoende aantal cellen te verkrijgen in een monster.
- Plaats de vloeistof op glasplaatje, en laat de vlek volledig drogen bij kamertemperatuur. Na droging kunnen deze estrous uitstrijkjes direct worden gemerkt of bewaard en gekleurd later.
3. Cytologische kleuring met behulp van Crystal Violet * 4
- Plaats de droge dia in een Coplin pot (of andere vergelijkbare kleuring schip) met de kristal violet kleuring voor 1 min.
- Verwijderen om een tweede Coplin pot met ddH 2 O. Was de dia met ddH 2 O 1 minuut. Herhalen.
- Verwijder de overtollige ddH 2 O van de randen van de dia met een lichte weefsel wisser, het vermijden van contact met de gekleurde uitstrijkjes.
- Pipetteer ongeveer 15 pl glycerol bovenop het uitstrijkje en dekselslip. Als alternatief kunnen andere histologische montage reagentia worden gebruikt om een permanente diffusievaste vlek verkrijgen.
* De kleuring hier beschreven is het eenvoudigst kan worden uitgevoerd in een laboratorium. Andere methoden kunnen extra informatie. Bijvoorbeeld met behulp van Papanicolaou kleuring, kan de looptijd van kernhoudende epitheelcellen worden onderscheiden met minder rijpe cellen gekleurd turkoois en meer volwassen cellen roze-of oranje-gekleurd. Deze verschillen kunnen gebruikt worden om vroege of late stadium proestrus. 4
4. Vaginale Cytologie
- Onderzoek de uitstrijkjes onder een lichtmicroscoop te bepalen celtypes aanwezig. Microscopisch onderzoek moet onmiddellijk worden gedaan na kleuring als het kristal violet zal uit de cellen diffunderen na verloop van tijd, wanneer er gebruik glycerol voor afdekken. Microfoto worden gehouden op het moment van analyse cytologie documenteren.
- Begin met het onderzoek van de entire uitstrijkje bij een lagere vergroting. Selecteer een representatieve gedeelte en verhuizen naar een hogere vergroting. Ziet verhoornde squamous epitheelcellen, leukocyten en / of kern epitheelcellen (representatieve resultaten, Figuur 1A-C). De verhouding van cellen die aanwezig zal u toelaten om de oestrische stadium van de muis te bepalen op het moment van het nemen van monsters (representatieve resultaten, Figuur 1D-G) en haar directe hormonale status (discussie, figuur 2).
5. Representatieve resultaten
Cytologie: Drie primaire celtypen kunnen worden gedetecteerd in vaginale uitstrijkjes: (1) kernhoudende epitheelcellen (Figuur 1A), (2) verhoornde squameuze epitheelcellen (Figuur 1B), en (3) leukocyten (Figuur 1C). Kernhoudende epitheliale cellen hebben een licht gekleurd cytoplasma, donkerder gekleurd plasmamembraan, en een ovaal kern (
Staging: De relatieve verhouding van celtypen waargenomen in uitstrijkjes kan worden gebruikt om het stadium van de loopsheid van de muis identificeren op de dag van de bemonstering (Figuur 1D-G). Tijdens pro-oestrus, cellen zijn vrijwel uitsluitendclusters van ronde, goed gevormde gekiemd epitheelcellen (Figuur 1D, representatieve cel aangegeven door witte pijl). Tijdens oestrus, worden de cellen voornamelijk verhoornde plaveiselcellen epitheelcellen, aanwezig in dicht op elkaar gepakte clusters (figuur 1E, vertegenwoordiger cel aangegeven met pijlpunt). Tijdens metestrus, kleine donkergekleurde leukocyten overheersen (Figuur 1F, vertegenwoordiger cel aangegeven met zwarte pijl). Verhoornde squamous epitheliale cellen worden waargenomen, vaak in fragmenten (Figuur 1F representatief cel aangegeven door zwarte pijl). Tijdens diestrus, zeldzame verhoornde squameuze epitheelcellen kunnen nog (figuur 1G, vertegenwoordiger cel aangegeven met zwarte pijlpunt), maar leukocyten nog steeds de overhand hebben (figuur 1G, vertegenwoordiger cel aangegeven met zwarte pijl). Metestrus kunnen worden onderscheiden van diestrus door het verschijnen van kernhoudende epitheelcellen in diestrus (
Figuur 1. Cytologisch onderzoek van vaginale uitstrijkjes kan worden gebruikt om estrous fase worden drie belangrijkste celtypes worden gedetecteerd in vaginale uitstrijkjes:. (A) kern epitheelcellen, (B) cornified squameuze epitheelcellen en (C) leukocyten. De verhouding van deze celtypen in de uitstrijkjes kan worden gebruikt om muizen (D) proestrus, (E) estrus, (F) metestrus of (G) diestrus zoals beschreven in representatieve resultaten identificeren. Zwarte pijlpunten in E, F en G wijs representatieve cornified squamous epitheliale cellen. Zwarte pijlen in C, F en G wijzen op representatieve leykocytes. Witte pijlen in D en G hoogtepunt vertegenwoordiger kernhoudende epitheelcellen.
. Jpg "alt =" Figuur 2 "/>
Figuur 2. Vaginaal uitstrijkje cytologie weerspiegelt onderliggende endocriene evenementen. Details zijn ook aanwezig in discussie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Urinezuurkristallen aanwezig kunnen volgende kristalviolet kleuring van urine-verontreinigde monsters zijn. (A) Kristallen transparant zijn en kunnen van verschillende grootte (pijlen en boxed regio vergroot in de (B)). Geen cellen aanwezig in dit gebied. Mocht urinezuur kristallen verontreiniging in gebieden gebruikt voor cytologische vlekken aanwezig zijn, kan het moeilijk zijn om nauwkeurig te identificeren celtypen aanwezig en het uitstrijkje moet worden weggegooid. Schaal bar = 50 um.
Discussion
Deze veranderingen in cel typologie zijn indicatief van de onderliggende endocriene evenementen. De proestrus fase van de loopsheid overeenkomt met de menselijke folliculaire fase van de menstruele cyclus 5 en wordt gedefinieerd door een pre-ovulatoire verhoging van de circulerende 17-β-oestradiol niveaus 6, alsmede een kleine stijging van prolactine 7 (figuur 2, pro-oestrus, linker paneel). De verhoging van 17-β-estradiol stimuleert indirect gonadotropin releasing hormone neuronen in de hypothalamus en septum dat op zijn beurt reactieve cellen te activeren op de hypofysevoorkwab om luteïniserend hormoon en follikelstimulerend hormoon vrij in de circulatie 8,9 (figuur 2 , Proestrus, linker paneel). In uitstrijkjes dieren genomen in proestrus cellen bijna uitsluitend ovaal kernhoudende epitheelcellen (Figuur 1D, fig. 2 Proestrus, rechter paneel). De piek van het follikel-stimulerend Hormeen niveau signalen ovulatie en toegang tot estrus 10,11. Tijdens oestrus, 17-β-oestradiol-spiegels afnemen en prolactine niveaus een piek 6,7 (figuur 2, Estrus, linker paneel). Vaginale uitstrijkjes worden gekenmerkt door bijna exclusieve detectie van onregelmatig gevormde cornified squamous epitheliale cellen vaak in groepjes (Figuur 1E, figuur 2 Estrus, rechter paneel). Inwerking metestrus samenvalt met een voortdurende stijging van progesteron niveaus 6 en komt overeen met het begin van menselijke luteale fase 12 (figuur 2 Metestrus, linkerpaneel). Zoals progesteron niveaus beginnen te stijgen en er een kleine stijging in 17-β-oestradiol in reactie op corpus luteum activatie 6,13,14 (figuur 2 Metestrus, linkerpaneel). De celtypes aanwezig in vaginale uitstrijkjes tijdens deze fase zijn gefragmenteerd, verhoornde epitheelcellen en kleinere donkerder gekleurd leukocyten (Figure 1F, fig. 2 Metestrus, rechter paneel). Tenslotte inwerkingtreding diestrus bij muizen voorkomt en circulerende progesteron piek 6, overeenstemmend met het menselijk late luteale fase 12. Regressie van het corpus luteum leidt tot een volgende scherpe daling van progesteron levels 15,16 (figuur 2, Diestrus, linker paneel). Leukocyten overheersen in uitstrijkjes tijdens diestrus. De frequentie van verhoornde epitheelcellen verlaagd en gekiemd epitheelcellen beginnen vlak voor overgang naar proestrus (Figuur 1G, figuur 2 Diestrus, rechter paneel) worden gedetecteerd.
Samenvattend kan dit eenvoudige, routinematige protocol worden gebruikt om de dagelijkse hormonale schommelingen te schatten en oestrische fase in experimentele muizen vast te stellen zonder dat de voortplanting beschouwd indien de volgende voorzorgsmaatregelen worden getroffen. Bemonstering niet meer worden uitgevoerd dan eenmaal daags met de niet-invasieve protocol deschier ribed vergeleken met herhaalde penetratie van de vagina, aspiratie en agitatie. Dit kan vaginale irritatie leidt tot een ontstekingsreactie 17 waardoor leukocyten en andere celtypen aanwezig in uitstrijkjes die cytologisch onderzoek kunnen beïnvloeden. Bovendien, zelfs in kolonie gehuisvest vrouwen, is het normaal om uitgebreide diestrus en oestrus stadia te zien in verschillende muizen en inductie van anestrous 18 en deze identificatie is nuttig bij de interpretatie van hormonale effecten in de reproductieve, geslacht en ziekte studies. Variabiliteit in cycluslengte wordt geïntroduceerd met de leeftijd en van woningcorporaties verschillen binnen kolonies (individueel of in groep-behuizing) van de vrouwen 7,19-21. Vrouwtjes gehuisvest in vrouwelijke alleen-kolonies kunnen ophouden fietsen en voer een toestand van langdurige diestrus 18,22,23 maar fietsen kan hervat worden door blootstelling aan kooien voorbehandeld met mannelijke urine te fietsen 24,25 lokken. Dus om vast individual cycluslengtes voor een bepaalde muis wordt aanbevolen dat de niet-invasieve evaluatie beschreven dagelijks worden uitgevoerd met zorg tot twee volledige cycli waargenomen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten. Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Ottawa Animal Care Comite en de Canadese Raad van Animal Care in te stellen.
Acknowledgments
Wij willen Marc Leonard danken aan de Carleton Immersive Media Studio voor deskundige technische bijstand in videoproductie en bewerken en Dr Martin Bertrand van Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Laboratorium voor visueel model hulp. De auteurs zijn zeer erkentelijk het deskundig advies van Dr Marilyn Keaney en al haar toegewijde personeel aan de Universiteit van Ottawa Animal Care en veterinaire diensten. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) aan Salb, de CIHR Instituut voor Aging en strategische Training Initiative in Health Research / CIHR Training Program in Neurodegeneratieve lipidomics (TGF 96121) om Salb en SF, de Canadese Stichting voor Innovatie naar SF, Ontario Innovation Trust naar SF, en Autodesk onderzoek naar SF. ACM ontvangt een CIHR Banting en Best promotie award. NV ontvangt een post-professionele beurs van Institute of Aging en CIHR Training Program in neurodegeneratieve lipidomics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 | |
| Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 | |
| Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Microscope Cover Glass (22x30) | Fisher | 12-544A |
References
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
