Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, og Vaginal Cytologisk Evaluation for Mouse estrale periode Staging Identifikation

Summary

Her beskriver vi, hvordan man identificerer den fase af murine reproduktive (proestrus brunst, metestrus eller diestrus) ved simpel, ikke-invasiv indsamling og cytologisk vurdering af vaginal udstrygningsprøver. Vi beskriver endvidere, hvordan vaginal cytologi afspejler cirkulerende hormonelle niveauer underliggende overgang gennem den murine reproduktive cyklus.

Abstract

En hurtig måde at vurdere reproduktiv status hos gnavere er ikke kun nyttig i studiet af reproduktive dysfunktion, men er også nødvendigt for produktionen af ​​nye musemodeller for sygdommen og undersøgelser i den hormonale regulering af væv degeneration (eller regenerering) efter patologisk udfordring. Den murine reproduktiv (eller østrus) cyklus er opdelt i 4 faser: proestrus oestrus, metestrus og diestrus. Definerede udsving i cirkulerende niveauer af ovariesteroider 17-β-østradiol og progesteron, gonadotropinerne luteiniserende og follikelstimulerende hormoner, og luteotropic hormonet prolaktin signalovergang gennem disse reproduktive stadier. Ændringer i celle typologi i den murine skeden afspejler disse underliggende endokrine begivenheder. Daglig vurdering af det relative forhold mellem kerneholdige epitelceller, forhornede skæl-epitelceller og leukocytter forekommer i vaginale udstrygninger kan anvendes til at identificere muse østrustrin. Graden af ​​invasiv imidlertid anvendes til indsamling af disse prøver kan ændre reproduktionsstatus og fremkalder en inflammatorisk reaktion, kan forvirre cytologisk evaluering af udstrygninger. Her beskriver vi en enkel, ikke-invasiv protokol, som kan anvendes til at bestemme fase af estrale periode af en hun-mus uden at ændre sin reproduktive cyklus. Vi detaljer, hvordan at skelne mellem de fire faser af estrale cyklus ved indsamling og analyse af dominerende celle typologi i vaginale udstrygninger og vi viser hvordan disse ændringer kan fortolkes med hensyn til endokrin status.

Protocol

1. Klargøring Reagenser

1. For steril vaginal lavage, autoklaver dobbelt destilleret vand (ddH ₂ O) og opbevares i en tæt lukket beholder ved stuetemperatur indtil brug.
2. For cytologisk evaluering, tilsættes 0,1 g krystalviolet pulver til 100 ml af DDH ₂ O. Bland godt. Krystalviolet farvning (0,1%) kan opbevares i en tæt lukket beholder ved stuetemperatur indtil brug.

2. Indsamling vaginale celler (Vaginal Lavage)

1. Placer en latex pære på enden af en steril 200 ul spids og udarbejde cirka 100 ul sterilt ddH ₂ O ved hjælp af overgange på spidsen som en volumen retningslinje.
2. Løft musen ud af sit bur og placere hende på buret tragt (låg) med hendes hind / bagende mod dig.
3. Tag godt fat om halen og ophøje den bageste ende. Musen har nu kun hendes forpoter gribende tragten. På dette tidspunkt musen kan lade vandet. Hvis ja, Vente, indtil vandladning stopper. Skulle der være urin tilbage ved indgangen til skeden, kan du ønsker at skylle åbningen med overskud ddH ₂ O ved hjælp af en separat spids (dvs. ikke din prøve samling tip).
4. Anbring enden af ddH ₂ O fyldt spids ved åbningen i vaginalkanalen idet man ikke trænge ind i åbningen som vaginal (og cervikal) stimulation kan inducere pseudodrægtighed i rotter ^1,2. De seneste rapporter tyder på mus er mindre modtagelige for denne effekt ikke desto mindre skal sørges for at minimere graden af invasivitet i gentagne analyser ^3.
5. Tryk let pæren at udvise en fjerdedel til halvdelen af ​​den mængde vand (~ 25-50 pl) ved åbningen af ​​skeden. Væsken vil spontant aspireres ind i kanalen uden spids insertion. Slip langsomt presset på pæren. Væsken vil trække tilbage i spidsen. Undgå frigivelse af trykket for hurtigt at forebygge aspiration af væsketil pæren. En filtreret spids kan være nyttigt til dette formål.
6. Gentag det foregående trin 4-5 gange med samme spids, pære, og fluidum til opnåelse af et tilstrækkeligt antal celler i en enkelt prøve.
7. Placer væske på objektglas, og lade smøre helt tørre ved stuetemperatur. Når tør, kan disse østrus smears farves straks eller opbevares og farvet på et senere tidspunkt.

3. Cytologisk farvning med krystalviolet * ⁴

1. Anbring den tørre objektglas i en Coplin krukke (eller tilsvarende farvning beholder) indeholdende krystalviolet farvning for 1 min.
2. Flyt til en anden Coplin krukke indeholdende ddH ₂ O. Vask objektglasset med Hedeselskabet ₂ O i 1 min. Gentag.
3. Fjern den overskydende ddH ₂ O fra kanten af objektglasset med en lys-duty væv vinduesvisker, undgå kontakt med den farvede smear.
4. Pipette cirka 15 pi af glycerol oven på smear og dæksletglide. Alternativt kan andre histologiske montering reagenser anvendes til opnåelse af en mere permanent, ikke-diffunderende farve.

* Farvningen her beskrevne fremgangsmåde er den enkleste fremgangsmåde, kan udføres på alle laboratorier. Andre metoder kan give yderligere oplysninger. For eksempel ved anvendelse af Papanicolaou-farvning kan løbetiden for kerneholdige epitelceller skelnes med mindre modne celler farves turkis og mere modne celler pink-eller orange-farvede. Disse forskelle kan anvendes til at afvikle tidlige og sene proøstrus. ^Fire

4. Vaginal cytologi

1. Undersøg smøre under lysmikroskopi at bestemme celletyper til stede. Mikroskopisk undersøgelse bør ske umiddelbart efter farvning som krystalviolet vil diffundere fra cellerne over tid, når du bruger glycerol til dækglas. Mikrofotografier skal tages på tidspunktet for analysen at dokumentere cytologi.
2. Start med at undersøge entire udstrygning ved en lavere forstørrelse. Vælg et repræsentativt område og flytte til en større forstørrelse. Man vil se forhornede skæl-epitelceller, leukocytter, og / eller kerneholdige epitelceller (repræsentative resultater, Figur 1A-C). Forholdet af celler til stede, vil give dig mulighed for at bestemme den østrus fase af musen på tidspunktet for prøvetagning (repræsentative resultater, figur 1D-G) og hendes umiddelbare hormonel status (diskussion, figur 2).

5. Repræsentative resultater

Cytologi: Tre primære celletyper kan detekteres i vaginale udstrygningsprøver: (1) kerneholdige epitelceller (figur 1A), (2) forhornede skæl-epitelceller (figur 1B), og (3) leukocytter (figur 1C). Kerneholdige epitelceller har en let farvet cytoplasma, mørkere farvede plasmamembran, og en oval kerne ( (Figur 1 B). Polymorfonukleære leukocytter kan skelnes fra epitelceller ved deres uregelmæssige form, mørktfarvede polymorfe kerner, og den lille størrelse (figur 1C, sorte pile). Bør urinen kontaminering være til stede i smear, er urinsyre krystaller lettere at bestemme ved deres krystallinske strukturer uens til enhver forventet celletyper (figur 3). Skulle dette ske, og obskure påvisning af dominerende celletype, skal smøre kasseres og ikke anvendes til mellemstationer formål.

Staging: Den relative forhold mellem celletyper observeret i udstrygningspræparater kan anvendes til at identificere det stadium af estrale periode på musen på dagen for prøveopsamling (figur 1D-G). Under proøstrus, er celler næsten udelukkendeklynger af runde, velformede nukleeret epithelceller (figur 1D, repræsentant celle angivet med hvid pil). Under brunst, celler overvejende forhornede pladeepitelceller, som findes i tætpakkede klynger (fig. 1E, repræsentant celle angivet med pilespids). Under metestrus, dominerer små mørktfarvede leukocytter (figur 1F, repræsentativ celle angivet med sort pil). Forhornede pladeepitelceller kan observeres, ofte i fragmenter (figur 1F, repræsentativ celle angivet med sort pil). Under diestrus, kan sjældne forhornede pladeepitelceller stadig være til stede (figur 1G, repræsentativ celle angivet med sort pil), men leukocytter stadig fremherskende (fig. 1G, repræsentativ celle angivet med sort pil). Metestrus kan skelnes fra diestrus ved fremkomsten af ​​kerneholdige epitelceller i diestrus ( g> Figur 1G, repræsentant celle angivet med hvid pil).

Figur 1. Cytologisk evaluering af vaginale udstrygninger kan anvendes til at identificere østrus fase tre hovedtyper af celler, påvises i vaginale udstrygningsprøver:. (A) kerneholdige epitelceller, (B) forhornede skæl-epitelceller, og (C) leukocytter. Forholdet mellem disse celletyper, der findes i smear kan anvendes til at identificere mus i (D) proøstrus, (E) oestrus, (F) metestrus, eller (g) diestrus som beskrevet i repræsentative resultater. Sorte pile i E, F og G peger på repræsentative forhornede skæl-epitelceller. Sorte pile i C, F og G peger på repræsentative leykocytes. Hvide pile i D og G highlight repræsentant nukleeret epitelceller.

. Jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Vaginal smøre cytologi afspejler underliggende endokrine begivenheder. Detaljer findes også i diskussionen. Klik her for at se større figur .

Figur 3. Urinsyre krystaller kan være til stede efter krystalviolet farvning af urin-forurenede prøver. (A) Krystaller er gennemsigtige og kan være af forskellige størrelser (pile og boxed region forstørres i (B)). Ingen celler er til stede i dette område. Bør urinsyre krystal forurening i områder, der anvendes til cytologisk farvning være til stede, kan det være vanskeligt præcist at identificere celletyper stede og smøre skal kasseres. Scale bar = 50 | jm.

Discussion

Disse ændringer i celle typologi er tegn på underliggende endokrine begivenheder. Den proøstrus fase af estrale periode svarer til den humane follikulære fase af menstruationscyklen ⁵ og er afgrænset af en præ-ovulatoriske stigning i cirkulerende 17-β-østradiol ^6, og en lille stigning i prolactin ⁷ (figur 2, proøstrus, venstre panel). Stigningen i 17-β-estradiol indirekte stimulerer gonadotropin-frigivende hormon neuroner i hypothalamus og septum, der på sin side aktiverer responsive celler i hypofyseforlappen at frigive luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon i kredsløbet ^8,9 (figur 2 , proøstrus, venstre panel). I vaginale udstrygninger fra dyrene i proøstrus, er celler næsten udelukkende ovale kerneholdige epitelceller (figur 1D, figur 2, proøstrus, højre panel). Toppen i follikelstimulerende Hormen niveauer signaler ægløsning og trådt i brunst ^10,11. Under oestrus, niveauer 17-β-østradiol falde, og prolactin-niveauer peak ^6,7 (fig. 2, oestrus, venstre panel). Vaginale udstrygninger er karakteriseret ved næsten udelukkende påvisning af uregelmæssigt formede forhornede skæl-epitelceller ofte i klumper (figur 1E, figur 2, oestrus, højre panel). Træder i metestrus falder sammen med en fortsat stigning i progesteron hormon niveauer ⁶ og svarer til begyndelsen af human luteale fase ¹² (fig. 2, Metestrus, venstre panel). Da progesteron niveauer begynde at stige, og der er en lille stigning i 17-β-østradiol som reaktion på corpus luteum aktivering ^6,13,14 (fig. 2, Metestrus, venstre panel). De celletyper stede i vaginale udstrygninger i denne fase er fragmenterede, forhornede epithelceller og mindre mørkere farvede leukocytter (Figure 1F, figur 2, Metestrus, højre panel). Endelig træder i diestrus i mus forekommer og cirkulerende progesteron niveauer peak ^6, svarende til den humane sen luteal fase ^12. Regression af corpus luteum fører til en efterfølgende kraftigt fald i progesteronniveauer ^15,16 (fig. 2, Diestrus, venstre panel). Leukocytter dominerer i udstrygningspræparater under diestrus. Frekvensen af forhornede epitelceller reduceres og kerneholdige epitelceller begynder at blive detekteret umiddelbart før overgangen til proestrus (figur 1G, figur 2, Diestrus, højre panel).

Sammenfattende kan denne enkle, rutine protokol bruges til at vurdere daglige hormonelle svingninger og etablere østrus etape i forsøgsmus uden at ændre reproduktive status, hvis følgende forholdsregler er taget. Prøverne udtages højst en gang dagligt under anvendelse af ikke-invasive protokol described her sammenlignet med gentagen indtrængning i vaginalkanalen, aspiration, og omrøring. Dette kan forårsage vaginal irritation resulterer i en inflammatorisk respons ¹⁷ resulterer i leukocyter og andre celletyper til stede i udstrygningspræparater, som kan forvirre cytologisk evaluering. Selv i koloni opstaldede hunner, er det normalt at se udvidede diestrus og østrus stadier i forskellige mus samt induktion af anestrous ¹⁸ og denne identifikation er nyttig i fortolkningen af hormonal virkning i reproduktiv, køn og sygdom studier. Variation i cyklus længde er også indført med alderen og ved boliger forskelle i kolonier (individuel eller gruppe-kabinet) af hunner ^7,19-21. Hunner huse i kvindedominerede kun kolonier kan ophøre cykling og indtaste en tilstand af langvarig diestrus ^18,22,23 selvom cykling kan genindsættes ved udsættelse for bure forbehandlet med mandlig urin for at fremkalde cykling ^24,25. Således, at etablere individual cykluslængder for en given mus, anbefales det, at de ikke-invasive vurderinger er beskrevet her udføres dagligt, med forsigtighed, indtil to fuldstændige cyklusser overholdes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile 200 μl pipette tips	Diamed	E340901
Latex bulb (1 ml)	Fisher	03-488-21
Glass microscope slides	Fisher	12-550-15
Crystal Violet stain (25 g)	Fisher	C581-25
Light-duty Tissue Wipers	VWR	82003-820
Glycerol	Fisher	BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30)	Fisher	12-544A