Das Insekt<em> Galleria mellonella</em> Als leistungsfähiges Infektion Modell zur bakterielle Pathogenität Untersuchen
Summary
Mündliche und intra haemocolic Infektion der Larven der größeren Wachsmotte<em> Galleria mellonella</em> Beschrieben. Das Insekt kann verwendet werden, um Virulenzfaktoren entomopathogener sowie Säugetierzellen opportunistische Bakterien zu untersuchen. Aufzucht der Insekten, Methoden der Infektion und Beispiele<em> In vivo</em> Analyse beschrieben.
Abstract
Das Studium der bakteriellen Virulenz erfordert oft einen geeigneten Tiermodell. Mammalian Modelle Infektion sind kostspielig und können ethische Probleme aufwerfen. Die Verwendung von Insekten-Infektion Modelle bietet eine wertvolle Alternative. Im Vergleich zu anderen nicht-Vertebraten Modell Hosts wie Nematoden, Insekten haben ein relativ fortgeschrittenes System der antimikrobiellen Abwehr und sind somit eher einschlägigen Informationen zu den Säugetieren Infektion herzustellen. Wie bei Säugetieren besitzen Insekten eine komplexe angeborene Immunsystem 1. Zellen in der Hämolymphe der Lage sind, phagozytierenden oder Einkapseln mikrobielle Invasoren und humorale Reaktionen gehören die induzierbare Produktion von Lysozym und kleine antibakterielle Peptide 2,3. Darüber hinaus werden Analogien zwischen den Epithelzellen von Insekten Larven Mitteldärmen und Darmzellen von Säugetieren Verdauungssystem gefunden. Schließlich mehreren Basiskomponenten essentiell für die bakterielle Infektion Verfahren wie Zelladhäsion, Resistenz gegenantimikrobielle Peptide, Gewebeabbau und Anpassung an oxidativem Stress sind wahrscheinlich in beiden Insekten und Säugern 1 wichtig. Somit sind Insekten polyvalenten Werkzeuge für die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Virulenzfaktoren in Säugetier Infektionen beteiligt.
Larven des größeren Wachsmotte Galleria mellonella ist gezeigt worden, um eine nützliche Einblick in die Pathogenese einer Vielzahl von mikrobiellen Infektionen, einschließlich Säuger-Pilz (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) und bakterieller Pathogene, wie Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris bereitzustellen , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes oder Enterococcus faecalis 4-7. Unabhängig von den Bakterienarten, die Ergebnisse mit Galleria Larven durch direkte Injektion durch die Kutikula infiziert konsistent mit denen von simi korrelieren erhaltenlar Säugetieren Studien: Bakterienstämme, die gedämpft in Säugetierzellen Modelle sind zu demonstrieren niedrigerer Virulenz in der Galleria und Stämme verursacht schwere Infektionen beim Menschen sind auch sehr virulent in der Galleria-Modell 8-11. Oral Infektion Galleria ist viel weniger genutzt und zusätzliche Verbindungen, wie bestimmte Toxine, sind erforderlich, um die Sterblichkeit zu erreichen.
G. mellonella Larven vorhanden mehrere technische Vorteile: Sie sind relativ groß (letzten Larvenstadium vor der Verpuppung sind etwa 2 cm lang und Gewicht 250 mg), so dass die Injektion von definierten Dosen von Bakterien, sie können bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden (20 ° C bis 30 ° C) und Infektionsstudien kann zwischen 15 ° C werden über 37 ° C 12,13 durchgeführt, so dass Versuche, das eine Säuger-Umgebung nachahmen. Darüber hinaus ist Insekt Aufzucht leicht und relativ billig. Infektion der Larven ermöglicht die Überwachung bakteriellen Virulenz durch verschiedene Mittel, including Berechnung der LD 50 14, Messung der Überlebensrate der Bakterien 15,16 und Prüfung der Infektion 17. Hier beschreiben wir die Aufzucht der Insekten, die alle Lebensphasen von G. mellonella. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll der Infektion auf zwei Wegen der Impfung: mündliche und intra haemocoelic. Die bakterielle Modell in diesem Protokoll ist Bacillus cereus, einem Gram-positive Erreger in gastrointestinalen sowie in andere schwere lokale oder systemische opportunistische Infektionen 18,19 verwickelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Einsatz von Insekten und vor allem das Larvenstadium, wie Infektionen Modelle für mehrere Erreger, wird immer häufiger. Ein Modell der Wahl für einige Aspekte ist Drosophila (die Fliege Modell) und Erwachsene Larvenstadium 1,2 verwendet. Die Lepidoptera G. mellonella wurde auch hauptsächlich zum Testen bakteriellen Virulenz durch Injektion verwendet. Der Vorteil tolerieren höheren Temperaturen (über 37 ° C) als Drosophila (maximal 25 ° C) ist wichtig, wenn Säuger Errege…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Elisabeth Guillemet, Christophe Buisson und Ludovic Bridoux für hervorragende technische Unterstützung danken. Wir sind zu großem Dank verpflichtet Sylvie Salamitou und Sinda Fedhila für die erste System-Setup.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Wax and pollen | La Ruche Roanaise | 303000 | Any honey producer |
| Automated syringe pump | KD Scientific | KDS 100 | |
| Syringe 1 ml | Terumo | BS 01T | |
| Needle 0.45 x 12 mm | Terumo | NN 2613R | |
| Petri dish 5 cm | VWR | 89000-300 | |
| Needle 30G, 25 mm hypodermic | Burkard Mfg. Co. Ltd. | PDE0005 |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions. Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).
- Dalhammar, G., Steiner, H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects. Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).
- Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
- Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).
- Chadwick, J. S. Serological responses of insects. Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).
- Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens. J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).
- Gao, W., et al. Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection. PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).
- Peleg, A. Y., et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection. J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).
- Salamitou, S., et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).
- Cadot, C., et al. InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).
- Rejasse, A., et al. Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).
- Jones, R. T., et al. Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment. BMC Microbiol. 10, 141 (2010).
- Finney, D. J. . Probit analysis. , (1971).
- Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route. J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).
- Guillemet, E., et al. The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence. J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).
- Bottone, E. J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).
- Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).
- Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54. Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).
- Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector. J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).
- Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence. J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).
- Tran, S. L., et al. Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).
- Fedhila, S., et al. Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).
- Daou, N., et al. IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin. PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).
- Mason, K. L., et al. From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta. MBio. 2, e00065-00011 (2011).
- Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori. Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).
- Fraser, M. J. Insect transgenesis: current applications and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).
