Summary
큰 왁스 나방의 애벌레의 구강 내부 haemocolic 감염
Abstract
박테리아 독성의 연구는 종종 적절한 동물 모델이 필요합니다. 감염의 포유류의 모델은 비용이 많이 들고 있으며, 윤리적 문제를 제기 할 수 있습니다. 감염 모델과 같은 곤충의 사용은 가치있는 대안을 제공합니다. 같은 nematodes와 같은 다른 비 척추 동물 모델 호스트에 비해 곤충은 항균 방어 비교적 고급 시스템을 가지고 있으며 따라서 더 포유류의 감염 과정에 관련 정보를 생성 할 가능성이 있습니다. 포유 동물과 마찬가지로, 곤충은 복잡한 타고난 면역 시스템 1을 보유하고 있습니다. hemolymph에있는 세포 미생물 침략자를 phagocytosing하거나 캡슐화 할 수 있으며, 체액 반응은 라이소자임 작은 항균 펩티드 2,3의 inducible 생산이 포함되어 있습니다. 또한, 유추는 곤충 애벌레의 midguts와 포유류의 소화 시스템의 장 세포의 상피 세포 사이에 발견된다. 마지막으로, 이러한 세포 부착, 저항 등의 세균 감염 과정에 필수적인 몇 가지 기본 구성 요소항균 펩티드, 조직 저하 및 산화 스트레스에 대한 적응은 곤충과 포유류 한 모두에 중요 할 가능성이 있습니다. 따라서, 곤충 포유류의 감염에 관련된 미생물 독성 요소의 식별 및 특성에 대한 여러 균을 혼합 한 도구입니다.
큰 왁스 나방 갤러리아 mellonella의 애벌레는 이러한 포도상 구균, 프로테우스의 vulgaris와 같은 포유류의 곰팡이 (Fusarium oxysporum, 누룩 곰팡이 fumigatus, 칸디다 알비 칸스) 및 세균성 병원체를 포함한 미생물 감염, 다양한 범위의 pathogenesis에 유용한 통찰력을 제공하기 위해 표시되었습니다 , Serratia marcescens 모나스 aeruginosa, 리스테리아 monocytogenes 또는 Enterococcus faecalis 4-7. 상관없이 박테리아 종, 결과는 큐티클을 통해 직접 분사에 감염 갤러리아 애벌레와 함께 지속적으로 시미의 그것과 상관 관계를 획득고맙다 포유류 연구 : 포유류의 모델 감쇠 아르 박테리아 변종은 갤러리아에서 낮은 독성을 보여줍니다, 그리고 심각한 인간 감염을 일으키는 변종도 갤러리아 모델 8-11에 매우 유독합니다. 갤러리아의 구강 감염이, 특정 독소와 같은 훨씬 덜 사용 및 화합물 추가됩니다는 사망률에 도달 할 필요합니다.
G. mellonella의 애벌레 존재하는 몇 가지 기술적 인 장점 : 사람들이 따라서 박테리아의 정의 복용의 주입을 사용 (pupation 전에 마지막 instar의 애벌레는 약 2 cm 길이, 무게 250 밀리그램입니다) 비교적 크기, 그들은 20 일 (다양한 온도에서 키운 할 수 있습니다 ° 30 ° C로 C) 및 감염 연구는 포유류의 환경을 모방 실험을 허용, 37 ° C 12,13 위를 15 ° C 사이에 실시 할 수 있습니다. 또한, 곤충 양육은 쉽고 상대적으로 저렴합니다. 애벌레의 감염은 여러 수단, includin에 의해 박테리아 독성을 모니터링 할 수 있습니다LD 50 14 g 계산, 박테리아 생존 15,16 및 감염 과정 17 시험의 측정. 여기, 우리는 G.의 모든 삶의 단계를 덮고, 곤충의 양육을 설명 mellonella. 구두 및 내부 haemocoelic : 우리는 접종의 두 경로로 감염에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에 사용되는 세균 모델은 바실루스 세레 우스, 위장뿐만 아니라 다른 심각한 지역 또는 조직 기회 감염 18,19에 연루 그램 긍정적 인 병원체이다.
Protocol
1. 곤충 양육
계란의 마지막 instar의 애벌레에 대한 모든 과정이 25 ° C.에 약 5 주 정도 1 개 또는 2 개 추가 주는 성인 나비를 얻기 위해 필요합니다.
- 최소 100 pupae 또는 새로 합병 성인 G.를 배치 5 리터 와이어 메쉬 케이지의 mellonella 나비. 남자 나비는 10~15mm을 측정합니다. 성인 남성이 나방은 희미한 빛과 어두운 표시가있는 베이지 색입니다. 20mm 주변의 여성 나비 측정. 암컷은 갈색 / 회색과 수컷보다 어두운입니다.
- 계란 부설에 대한 우리에 네 계층 종이 두 팩을 일시 중지합니다. 이일 후, 성인 여성은 신문 사이의 가장자리에 알을 낳는 것입니다.
- 일주일에 두 번, 꽃가루와 벌 왁스가 포함 된 공기가 순환하게하기 위해 격자로 새로운 플라스틱 양육 상자에 계란 종이 팩을 넣습니다. 알은 약 3 일 부화 작은 애벌레는 왁스와 화분에 공급하여 개발 시작합니다. 또한, 애벌레는 인공 다이어트 consistin에 배치 할 수 있습니다500g 액체 꿀, 400g의 글리세린, 100g 건조 맥주 효모, 250g의 밀가루, 200g 탈지 분유와 400g 폴렌타 죽의 혼합의 g. 유충 당 음식의 적절한 비율을 제공하기 위해 정기적으로 새로운 상자에 애벌레를 분리 모든 이틀 음식을 보충.
- 애벌레는 유충 경기장의 여섯 단계에서 키운 있습니다. 각 경기장은 유충의 머리 캡슐의 미끄럼이 특징입니다. 애벌레는 pupation 전에 마지막 단계에 도달하면, 그들은 먹이를 중지하고 가벼운 실크 누에 고치를 구축 시작합니다.
- 자신의 보호 고치에서 애벌레 휴식하고 pupae로 변환 할 수 있습니다. 왁스 웜은 성인 나방에 등장하는 1~2주의 번데기 단계에 남아 있습니다. 성인 나방은 술도 먹지 않습니다. 짝짓기가 발생하고 왁스 웜 '수명주기가 다시 시작됩니다.
- 병리 검정을 표준화하기 위해 마지막 애벌레의 단계에서 유충을. 이 단계에서 사람들이 먹이를 중지, 양육 상자의 덮개에 이동 실크를 생산하기 시작합니다. 이 Stage 5 일 주위 지속됩니다.
2. 감염에 대한 곤충 선택
- 감염 전에 마지막으로 instar 무게에 2-3cm 길이 180-250 밀리그램 아르 애벌레,, 24 시간을 선택하고을 굶어 빈 상자에 넣어 두 었어요.
- 애벌레 주변의 초기 실크 누에 고치를 제거합니다.
3. 세균 준비
- CFU / ML 1x10 8 CFU / 섭취에 대한 ML을 (CFU는 구하는 방법 10 4 식민지 성형 단위 (CFU) / ML에서 10 8 CFU / 내부 haemocoelic 분사에 대한 ML과 3x10 6에서까지 최종 농도를 얻기 위해 세균 세균 현탁액을 준비 LD 50) 박테리아 종에 따라 달라집니다. 우리의 경우, B.에 세레 우스는 Luria-Bertani 국물 매체에서 재배됩니다 (LB, 10g / L tryptone, 5g / L 효모 추출물, 10g / L NaCl) 37의 ° C 교반 이하까지 성장의 안으로 굽음에 해당하는 고정 단계로 진입, 곡선. OD 600 nm의를 (측정B. 1 사이 2 세레 우스)과 이전에 한 적정 곡선을 사용하여 세균 농도를 평가하는 데 사용합니다. 객실 온도와 인산의 resuspend 10 분 5,000 XG에서 원심 분리하여 수확 박테리아 (: 1M KH 2 PO 4, 100 K 2 HPO 4, 5M NaCl, pH를 7.2 PBS) 식염 버퍼링. 각 유충 원하는 농도에서 세균 현탁액의 10 μl를 받게 될 것입니다.
- 또한, 포자 현탁액은 감염을 준비 할 수 있습니다. sporulation 매체 HCT (5 G / L tryptone, 2 G / L 카세인 가수 분해물, 12.5 MM K 2 HPO 4, 12.5 MM MgSO 4, 0.05 MM MnSO 4, 1.2 MM ZnSO 4, 1.2 MM 철의 배양 세균을하여 포자를 얻을 2 (SO 4) 3, 0.5 % H 2 3 일 30 ° C 25 MM CaCl 2) 20, 4 SO. 수확 원심 분리하여 포자 (10,000 XG, 15 분) 및 멸균 증류수에 두 번 씻는다. 포자 펠를 Resuspend남은 식물 세균을 제거하는 78시 15 분 ° C에 멸균 증류수와 열에 표시 할 수 있습니다. LB 한천 플레이트에 시리얼 dilutions을 도금하여 정지 수계. 각 유충 원하는 농도에 포자 현탁액의 10 μl를 받게 될 것입니다.
4. 독소 준비 눈물
- B.에서 Cry1C 독소를 준비 thuringiensis 변형 407은 유전자 인코딩 Cry1C를 들고 플라스미드 pHTF31C 21 변환. 30 100 ML의 HCT 매체의 문화 변형 °와 72 시간을위한 C 전체 sporulation, 문화 표면에 뜨는에 독소 크리스탈 생산과 해방을 허용하도록 (에리스로 마이신 10mg/ml) 항생제.
- 72% -79 %의 자당 기울기에 표면에 뜨는에서 결정을 정화. 먼저 40 ML 튜브에 79 % 자당 17 ML를 추가합니다. 79 % 자당 위에 72%의 자당의주의 층 17 ML. 마지막으로, 레이어 5-6 10X 집중 sporulated 문화의 ML하고 관을 닫습니다. 20,00에서 14 시간 동안 튜브를 원심 분리기0 XG, 4 ° C는 포자의 결정을 분리합니다. 기울기 인터페이스에서 결정을 수집합니다. 그것을 씻어 25 ML 차가운 멸균 물에 크리스탈 펠렛을 Resuspend. 20 분에 8,000 XG에 원심 분리기. 이 단계는 결정에 집어 넣는 모든 자당을 제거하려면 세 번 반복됩니다. 5 ML 멸균 물에 결정을 Resuspend하고 순결을 평가하기 위해 현미경으로 관찰한다.
- 50 MM NaOH에 presolubilized 크리스탈 솔루션에 고전 브래드 포드 착색에 의해 독소 단백질 농도를 평가합니다. 독소 결정은 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
5. 주입기 준비
- 정확한 주입 볼륨을 제어하려면, 1 μl / 초 (그림 1A)에 설치 속도로 자동 주사기 펌프 (예 : KD 과학 KDS 100)을 사용합니다.
- 300 μl 물 1 ML의 피하 주사기 또는 20-25 애벌레의 감염 세균 솔루션 (조건 당 1 주사기)를 입력합니다. 조심스럽게 타하여 거품을 제거주사기 pping 다음 주사기에 0.45 X 12mm 바늘을 첨부합니다.
- 주입기에 주사기를 삽입합니다.
- 주입 된 볼륨을 제어 할 빈 튜브에 10 μl의 빈 주사를 수행합니다.
6. 곤충 Intrahaemocoelic 사출
- 엄지와 집게 손가락 사이에 수동으로 곤충를 놓습니다. 그런 다음 유충 피부 (표피) (그림 1C)에 분사기에서 해결 된 바늘을 삽입합니다.
- 10 μl 세균 솔루션을 (포자 또는 식물 박테리아) 주입하면서 장소에서 곤충세요.
- 조심스럽게 바늘에서 곤충을 제거합니다.
- 작은 페트리 접시 (직경 5cm), 음식 당 5 유충에 감염된 곤충를 놓습니다.
- 각 실험 조건에 대한 최소한 20 애벌레를 감염.
- 48 시간에 대한 보육에서 37 ° C에서 요리를 놓으십시오.
7. 곤충 강제 수유 (섭취)
- 2 ML Eppendorf 튜브에 0.2 μg / & m를 섞어U; 중 포자 나 식물 세포 현탁액과 Cry1C 독소 내가 3x10 4에서 10 μl 당 1x10 7에 이르기까지 최종 농도를 얻을 수 있습니다.
- 20-25 애벌레의 감염 세균 - Cry1C 독소 솔루션 300 μl과 30g의 25 밀리미터의 피하 주사기 바늘을 1 ML의 주사기를 채우십시오. 주사기에서 거품을 제거합니다.
- 수동 그래서 그 입을 바늘 (그림 1D) 분사기에서 해결하고, 자동화 된 주사기 펌프를 사용하여 세균 솔루션의 10 μl로 강제 먹이를 입력하는 곤충를 놓습니다.
- 각 실험 조건에 대한 최소한 20 애벌레를 감염.
- 작은 5cm 페트리 접시 (접시 당 5 유충)에 감염된 곤충를 놓습니다. 48 시간에 대한 보육에서 37 ° C에서 요리를 놓으십시오.
8. 녹화 곤충 사망률
- 힘 수유 또는 주입 실험을 한 후, 25에서 음식없이 배양 접시에있는 애벌레를 유지 ° C 또는 37 ° C. 애벌레의 몰리브덴을 확인48 시간 기간 동안 정기적으로 rtality. 죽은 유충은 불활성이며 일반적으로 검은 색을 (그림 1B) 설정합니다.
- 사망률 데이터는 로그 Probit 프로그램 14을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 이 프로그램은 선량 사망률 곡선의 선형성을 시험하고 치명적인 복용 (LD 50)을 제공합니다. 또한, 이러한 프리즘 (그래프 패드), 생존을 분석하거나 사망률 데이터 같은 다른 프로그램이 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
G.에 박테리아의 내부 haemocoelic 주입 mellonella는 여러 사람이 병원균의 타고난 면역 요인에 조직 손상 및 저항을 다루는 많은 독성 요소의 식별을 위해 매우 유용한 입증되었습니다. 예를 들어, 그림 2A는 B.의 다양한 복용의 주입 후 곤충 사망률을 나타냅니다 세레 우스 균 (야생 유형과 돌연변이 변종) 22. 그림 2B는 G 감염 후 세균 생존을 나타냅니다 녹농균 4로 mellonella.
B.에 구두 감염 모델 갤러리아의 사용 세레 우스와 B. thuringiensis는 Cry1C 독소 (10)의 insecticidal 활동에 식물 박테리아 나 포자의 시너지 효과의 평가에 의존하고 있습니다. 애벌레는 포자 / 독소 혼합물의 섭취에 민감한 만 Cry1의 섭취에 약하게 민감한혼자 C 독소. 박테리아 후 패혈증에서 애벌레의 죽음의 결과는 장 장벽의 붕괴 후 haemocoel에 도달했습니다. 그림 3은 크리스탈 섭취 후 애벌레의 사망률을 나타냅니다과 야생 형식이나 세균 박테리아 (10)의 돌연변이 변종 중.
몇몇 박테리아는 갤러리아에서 구두 감염 테스트되었습니다. 인간 병원균은 B.에게 테스트 사이 Cry1C 독소와 세레 우스 균은 G.에 가장 악성했다 구강 감염 후 24 mellonella. 이 방법은 감염 / gastro 창자의 식민지를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 4와 같이 실제로, 유충 소화 기관은 감염 후 추출 할 수 있으며, 숙주 세포의 수정뿐만 아니라 세균 식민지는 조직 학적 파라핀 섹션에 시각화 할 수 있습니다. 또한, 형광 박테리아의 섭취는 궤도와 식민지의 프로를 수행하는 데 사용할 수 있습니다애벌레의 다른 격실을 따라 운. 마지막으로, 다른 곤충 격실에있는 유전자의 특정 표현식은 형광 현미경 25에 의해 모니터링 할 수 있습니다.
그림 1. (A) 자동 주사기 펌프 주사기. (B) 죽은 (검정, 상단)과 살아 (아래, 화이트) G. mellonella의 애벌레. (C) 박테리아는 G.의 haemocoel에 주입 아르 mellonella의 애벌레. (D) G. mellonella의 애벌레는 박테리아 준비와 힘 - 먹이입니다 바늘은 곤충 애벌레의 입으로 들어간다.
그림 2. 내부 haemocoelic 주입 후 결과. G.에 대한 (A) CwpFM의 독성 mellonella의 애벌레 22. B. 다양한 농도 세레 우스 wilD-타입 (BT 407)와 ΔcwpFM 돌연변이의 변종은 20 G.의 haemocoel에 주사했다 mellonella의 애벌레. 사망률은 37 ° C. 24 시간 이후에 기록 된 G.에서 녹농균 PA14 감염 (B) 시간 코스 mellonella 4. 유충 당 스물 다섯 박테리아는 시간 제로에 주입했다. 애벌레는 지정된 시간 포인트 이후의 감염에 깔린되었고 박테리아 카운트은 도금에 의해 결정됩니다. 각 데이터 포인트는 10 유충의 10 그룹의 세균 카운트의 평균과 표준 편차를 나타냅니다. 세균 농도가 10 9 / g에 도달 할 때 애벌레는 주사 후 약 48 시간이 죽었습니다.
그림 3. G.의 pathogenicity의 평가 등의 포자와 Cry1C 독소의 크리스탈 Synergism 구강 섭취 10시 mellonella의 애벌레. G. mellonella의 유충전자는 구두 Cry1C 독소 크리스탈 (유충 당 1 μg) 또는 감염, 또는 10 6 B.로했다 thuringiensis의 포자, 또는 Cry1C 독소와 B의 혼합으로 thuringiensis의 포자. 유충의 사망률은 25 ° C. 48 시간 이후에 평가되었다
그림 4 애벌레의 구강 감염 :. 식민지와 세균의 조직 현지화. (A) 청색 색소 솔루션 10 μl은 G.의 입에 강제로 먹이에 의해 도입 된 mellonella의 유충. 유충은 청색 색소로 가득 장을 나타 내기 위해 해부했다. (B) BT 407 변형율 및 Cry1C 독소의 혼합물은 G.에 소개되었습니다 힘 수유로 mellonella의 애벌레. 24 시간 후, 전체 애벌레는 파라핀, 내장 잘라 내고 고정했다. 조직 학적 세로 섹션 (hematoxylin & Eosine와 그램 긴장) 얼룩 져 있었다. 빛 현미경 사진 (400X)은 내장 (어두운 보라색)를 보여줍니다 그램 스테인드 바실루스 (어두운 보라색)은 장 표면에서 번역. (C) BT의 혼합물이 407-GFP 형광 변형 및 Cry1C 독소는 G.에 소개되었습니다 힘 수유로 mellonella의 애벌레. 24 시간 후, 박테리아 haemocoel에 도달하고 곤충 시신은 B.로 가득 차 있습니다 녹색 형광 단백질을 표현 세레 우스. 생체 25 리사 식의 (D) 분석. epifluorescence의 현미경 관찰은 B. 수행되었습니다 pHT315 - pilsA'gfp을 들고 세레 우스. 박테리아는 구두 감염 후 죽은 유충 24 시간의 hemocoel으로부터 격리되었다. 녹색 박테리아는 리사업자의 활성화로 인해 GFP의 표현을 나타냅니다. 이것은 박테리아가 haemocoel에 도달 한이 유전자 (리사)의 특정 표현을 보여줍니다.
영화 1. 수집 구두에 따라 곤충 배에 솔루션의 확산이온. 청색 색소 솔루션 10 μl은 유럽 옥수수 천공 충 Ostrinia nubilalis의 유충의 입에 강제로 먹이에 의해 도입되었다. 염료 신속하게 곤충 애벌레의 장 루멘을 채 웁니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
곤충, 특히 애벌레의 단계의 사용은 여러 병원체에 대한 감염 모델로, 잦은되고 있습니다. 일부 측면에 대한 선택의 모델은 성인과 애벌레의 무대 1,2 모두로 사용 Drosophila (플라이 모델)입니다. lepidopteran 곤충 G. mellonella는 주로 주입하여 세균 독성을 시금에 사용되었습니다. 포유류의 병원체가 공부 할 때 Drosophila보다 높은 온도를 (37 ° C 이상) (최대 25 ° C) 참아의 장점은 중요합니다. 또한 갤러리아의 크기가 감염 동력학 및 조직 손상을 공부에 대한 더 많은 편리합니다. 마지막으로, 우리의 프로토콜은 소화 기관에 관한 연구에 대한 이점이 있습니다 구두 감염에 대한 갤러리아을 사용하는 가능성을 설명합니다. 마찬가지로, 또 다른 대형 애벌레, Manduca sexta의 애벌레의 단계는 구강 감염 26 최근 haemocoel에 주사하여 감염을 연구하는 데 사용하고있다.B. 모리와 27 순서가 아르 genomes Spodoptera 종도 흥미로운 대안을 제공하며, 호스트 유전자는 RNAi 방법 또는 기타 유전자 조작 (28)에 의해 종료 될 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 갤러리아 애벌레, 방법을 감염과 같은 모델의 가능성을 표시하기 위해 감염 과정과 점수 사망률를 수행하는 방법에 대한 몇 가지 예제를 뒤로 간단한 방법에 대해 설명합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원을 위해 엘리자베스 Guillemet, 크리스토프 Buisson와 Ludovic Bridoux 감사드립니다. 우리는 초기 시스템 설정을위한 Sylvie Salamitou 및 Sinda Fedhila 께 무한한 빚을 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax and pollen | La Ruche Roanaise | 303000 | Any honey producer |
| Automated syringe pump | KD Scientific | KDS 100 | |
| Syringe 1 ml | Terumo | BS 01T | |
| Needle 0.45 x 12 mm | Terumo | NN 2613R | |
| Petri dish 5 cm | VWR | 89000-300 | |
| Needle 30G, 25 mm hypodermic | Burkard Mfg. Co. Ltd. | PDE0005 |
References
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