Insekten<em> Galleria mellonella</em> Som en kraftfull infektion modell för att undersöka bakteriell patogenes
Summary
Muntlig och inom haemocolic infektion av larver av större vax mal<em> Galleria mellonella</em> Beskrives. Denna insekt kan användas för att studera virulensfaktorer av entomopatogena liksom däggdjur opportunistiska bakterier. Uppfödning av insekter, metoder för infektion och exempel på<em> In vivo</em> Analysen beskrivs.
Abstract
Studiet av bakteriell virulens kräver ofta en lämplig djurmodell. Mammalian modeller av infektion är kostsamma och kan ge upphov till etiska frågor. Användningen av insekter som infektionsmodeller ger ett värdefullt alternativ. Jämfört med andra ryggradslösa modell värdar som nematoder, insekter har en relativt avancerat system av antimikrobiella försvar och därmed mer benägna att producera information som är relevant för däggdjur infektionsprocessen. Liksom däggdjur, insekter har ett komplext medfödda immunsystemet 1. Celler i hemolymfa är kapabla phagocytosing eller inkapsling mikrobiella inkräktare, och humorala svar inkluderar inducerbara produktionen av lysozym och små antibakteriella peptider 2,3. Dessutom finns analogier finns mellan epitelceller insekter larver midguts och intestinala celler av däggdjur tarmsystem. Slutligen, flera grundläggande komponenter som är nödvändiga för den bakteriella infektionen processen såsom celladhesion, beständighet motantimikrobiella peptider, vävnadsnedbrytning och anpassning till oxidativ stress kommer sannolikt att vara viktiga i både insekter och däggdjur 1. Således insekter är polyvalenta verktyg för identifiering och karakterisering av mikrobiella virulensfaktorer inblandade i däggdjur infektioner.
Larver av större vax mal Galleria mellonella har visat sig ge en användbar inblick i patogenes av ett brett spektrum av mikrobiella infektioner inkluderande däggdjur svamp (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) och bakteriella patogener, såsom Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes eller Enterococcus faecalis 4-7. Oberoende av bakteriearter, resultat som erhållits med Galleria larver infekterade genom direkt injektion genom nagelband genomgående korrelerar med de liknande däggdjur studier: bakteriestammar som är försvagade i däggdjurs modeller visar lägre virulens i Galleria och stammar som orsakar allvarliga infektioner hos människa är också mycket virulenta i Galleria modell 8-11. Muntlig infektion av Galleria är mycket mindre använda och ytterligare föreningar, som vissa gifter, behövs för att nå dödlighet.
G. mellonella larver närvarande flera tekniska fördelar: de är relativt stora (sista stadiet larver innan förpuppning är ca 2 cm långa och vikten 250 mg), vilket möjliggör injektion av definierade doser av bakterier, de kan födas upp vid olika temperaturer (20 ° C till 30 ° C) och infektion studier kan utföras mellan 15 ° C och över 37 ° C 12,13, så att experiment som efterliknar en däggdjurs miljö. Dessutom, är insekter uppfödning lätt och relativt billigt. Infektion av larverna medger övervakning bakteriell virulens på olika sätt, including beräkning av LD 50 14, mätning av bakteriell överlevnad 15,16 och undersökning av infektionen processen 17. Här beskriver vi uppfödning av insekter, som omfattar alla stadier i G. mellonella. Vi erbjuder ett detaljerat protokoll av infektion av två vägar för ympning: muntlig och inom haemocoelic. Den bakteriella modell som används i detta protokoll är Bacillus cereus, en grampositiv patogener inblandad i mag liksom i andra svåra lokala eller systemiska opportunistiska infektioner 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av insekter och speciellt larvstadiet, som infektion modeller för flera patogener, blir vanligare. En modell av val för vissa aspekter är Drosophila (flyga modell) används som både vuxna och larvstadiet 1,2. Den lepidopteran insekt G. mellonella har också huvudsakligen använts för att analysera bakteriell virulens genom injektion. Fördelen med tolerera högre temperaturer (över 37 ° C) än Drosophila (max 25 ° C) är viktigt när däggdjur patogener ska stu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Elisabeth Guillemet, Christophe Buisson och Ludovic Bridoux för utmärkt tekniskt stöd. Vi är mycket skuld till Sylvie Salamitou och Sinda Fedhila för den första systeminställningsprogrammet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Wax and pollen | La Ruche Roanaise | 303000 | Any honey producer |
| Automated syringe pump | KD Scientific | KDS 100 | |
| Syringe 1 ml | Terumo | BS 01T | |
| Needle 0.45 x 12 mm | Terumo | NN 2613R | |
| Petri dish 5 cm | VWR | 89000-300 | |
| Needle 30G, 25 mm hypodermic | Burkard Mfg. Co. Ltd. | PDE0005 |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions. Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).
- Dalhammar, G., Steiner, H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects. Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).
- Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
- Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).
- Chadwick, J. S. Serological responses of insects. Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).
- Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens. J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).
- Gao, W., et al. Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection. PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).
- Peleg, A. Y., et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection. J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).
- Salamitou, S., et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).
- Cadot, C., et al. InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).
- Rejasse, A., et al. Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).
- Jones, R. T., et al. Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment. BMC Microbiol. 10, 141 (2010).
- Finney, D. J. . Probit analysis. , (1971).
- Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route. J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).
- Guillemet, E., et al. The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence. J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).
- Bottone, E. J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).
- Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).
- Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54. Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).
- Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector. J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).
- Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence. J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).
- Tran, S. L., et al. Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).
- Fedhila, S., et al. Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).
- Daou, N., et al. IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin. PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).
- Mason, K. L., et al. From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta. MBio. 2, e00065-00011 (2011).
- Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori. Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).
- Fraser, M. J. Insect transgenesis: current applications and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).
