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Immunology and Infection

L'insecte doi: 10.3791/4392 Published: December 11, 2012

Summary

Orale et intra infection haemocolic des larves de la teigne de la cire plus

Abstract

L'étude de la virulence bactérienne nécessite souvent un modèle animal approprié. Modèles de mammifères d'infection sont coûteux et peuvent soulever des questions éthiques. L'utilisation d'insectes comme des modèles d'infection constitue une alternative intéressante. Comparé à d'autres hôtes non vertébrés modèle comme les nématodes, les insectes ont un système relativement avancé des défenses antimicrobiennes et sont donc plus susceptibles de produire des informations pertinentes pour le processus d'infection chez les mammifères. Comme les mammifères, les insectes possèdent un complexe système immunitaire inné 1. Les cellules de l'hémolymphe sont capables de phagocyter ou d'encapsuler des envahisseurs microbiens et réponses humorales comprennent la production inductible de lysozyme et petits peptides antibactériens 2,3. En outre, les analogies se retrouvent entre les cellules épithéliales des insectes larvaires estomacs et les cellules intestinales de l'appareil digestif de mammifères. Enfin, plusieurs composantes de base essentielles pour le processus d'infection bactérienne telle que l'adhérence cellulaire, la résistance à lapeptides antimicrobiens, la dégradation des tissus et de l'adaptation au stress oxydatif sont susceptibles de jouer un rôle important dans les deux insectes et les mammifères 1. Ainsi, les insectes sont des outils polyvalents pour l'identification et la caractérisation des facteurs de virulence impliqués dans les infections microbiennes mammifères.

Les larves de la teigne plus grande Galleria mellonella ont été montré pour fournir un aperçu utile de la pathogenèse d'un large éventail d'infections microbiennes, y compris les mammifères fongiques (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) et des bactéries pathogènes, telles que Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes ou Enterococcus faecalis 4-7. Quelles que soient les espèces bactériennes, les résultats obtenus avec des larves infectées Galleria par injection directe à travers la cuticule toujours en corrélation avec ceux de similar des études de mammifères: les souches bactériennes qui sont atténuées dans les modèles de mammifères montrent moins virulents dans la Galleria, et des souches responsables de graves infections humaines sont également très virulent dans le modèle Galleria 8-11. L'infection orale de la Galleria est beaucoup moins utilisées et d'autre composés, comme des toxines spécifiques, sont nécessaires pour atteindre la mortalité.

G. mellonella larves présentent plusieurs avantages techniques: elles sont relativement importantes (dernier stade larvaire avant la nymphose ya environ 2 cm de long et un poids de 250 mg), ce qui permet l'injection de doses définies de bactéries, ils peuvent être élevés à différentes températures (20 ° études C à 30 ° C) et l'infection peut être effectuée entre 15 ° C et au-dessus de 37 ° C 12,13, ce qui permet d'expériences qui imitent un environnement de mammifère. En outre, l'élevage d'insectes est facile et relativement pas cher. Infection des larves permet de surveiller la virulence bactérienne par plusieurs moyens, includincalcul g de LD 50 14, mesure de la survie de la bactérie 15,16 et l'examen du processus d'infection 17. Ici, nous décrivons l'élevage des insectes, couvrant toutes les étapes de la vie de G. mellonella. Nous fournissons un protocole détaillé de l'infection par deux voies d'inoculation: haemocoelic orale et intra. Le modèle bactérienne utilisée dans ce protocole est Bacillus cereus, un agent pathogène à Gram positif impliquées dans gastro-intestinal ainsi que dans d'autres locaux ou systémiques sévères infections opportunistes 18,19.

Protocol

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1. Élevage des insectes

Le cycle entier de l'oeuf à larves du dernier dure environ 5 semaines à 25 ° C. Un ou 2 semaines supplémentaires sont nécessaires pour obtenir les papillons adultes.

  1. Placez au moins 100 nymphes ou adultes nouvellement fusionnée G. papillons mellonella dans un 5-litres cage grillagée. Papillons mâles mesurent 10 à 15 mm. Le papillon mâle adulte est de couleur beige avec une lumière faible et des marques sombres. Femme papillons mesure environ 20 mm. Les femelles sont plus sombres que les hommes avec une couleur marron / gris.
  2. Suspendre deux paquets de quatre couches de papier dans la cage pour la ponte. Après 2 jours, la femelle adulte pondent des œufs sur le bord entre les documents.
  3. Deux fois par semaine, placer les paquets d'œufs en papier dans de nouvelles boîtes d'élevage en plastique avec des grilles pour laisser l'air circuler, contenant du pollen et de cire d'abeille. Les oeufs éclosent au bout de 3 jours et les petites larves commencent à se développer en se nourrissant de la cire et de pollen. Alternativement, les larves peuvent être placés sur une alimentation artificielle consisting d'un mélange de 500 g de miel liquide, 400 g de glycérine, 100 g de levure de bière séchée, 250 g de farine de blé, 200 g de poudre de lait écrémé et 400 g de polenta. Pour fournir ratio approprié de nourriture par larves, régulièrement séparer les larves dans de nouvelles boîtes et remplir les plats tous les deux jours.
  4. Larves sont élevées au cours des six étapes du stade de larve. Chaque stade est caractérisé par le glissement de la capsule de la tête de larves. Lorsque les larves atteignent le dernier stade avant la nymphose, elles cessent de se nourrir et de commencer à construire un cocon de soie légère.
  5. Dans leurs cocons protecteurs, les larves se reposer et se transforment en chrysalides. Vers de cire restent dans le stade de pupe pendant une à deux semaines pour émerger dans papillons adultes. Les papillons adultes ne boire ni manger. L'accouplement a lieu et le cycle de vie des vers de cire »recommence.
  6. Pour normaliser le dosage pathologie, prendre les larves au dernier stade larvaire. Au cours de cette étape, ils cessent de se nourrir, se déplacer sur le couvercle de la boîte de l'élevage et de commencer à produire de la soie. Ce stage dure environ 5 jours.

2. Sélection des insectes de l'infection

  1. Sélectionnez dernier stade larvaire, qui sont 2-3 cm de long et de 180 à 250 mg en poids, 24 heures avant l'infection et les mettre dans une boîte vide de les affamer.
  2. Retirez le cocon de soie naissante autour des larves.

3. Préparation bactérienne

  1. Préparer les suspensions bactériennes de Bacillus pour obtenir des concentrations finales allant de 10 4 unités formant colonies (UFC) / ml à 10 8 UFC / ml pour injection intra haemocoelic et de 3x10 6 UFC / ml à 1x10 8 UFC / ml pour l'ingestion (ufc pour obtenir l' une DL 50 dépend des espèces bactériennes). Dans notre cas, B. cereus est cultivé en milieu Luria-Bertani Broth (LB, 10 g / l de tryptone, 5 g d'extrait de levure / l, 10 g / l de NaCl) à 37 ° C sous agitation jusqu'à ce que l'entrée en phase stationnaire, ce qui correspond à l'incurvation de la croissance courbe. Mesurer les DO 600 nm (entre 1 et 2 pour B. cereus) et l'utiliser pour évaluer la concentration bactérienne, en utilisant une courbe de titrage déjà fait. Récolte des bactéries par centrifugation à 5000 xg pendant 10 min à température ambiante et remettre en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS: 1M KH 2 PO 4, 1M K 2 HPO 4, 5 M de NaCl, pH 7,2). Chaque larve recevra 10 ul de suspension bactérienne à la concentration souhaitée.
  2. Alternativement, suspension de spores peuvent être préparés à l'infection. Obtenir des spores en cultivant les bactéries dans le milieu de sporulation HCT (5 g / l de tryptone, 2 g / l d'hydrolysat de caséine, 12,5 mM de K 2 HPO 4, 12,5 mM MgSO 4, 0,05 mM de MnSO 4, 1,2 mM de ZnSO 4, 1,2 mM Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% de H 2 SO 4, 25 mM de CaCl 2) 20 à 30 ° C pendant 3 jours. Spores de récolte par centrifugation (10.000 xg, 15 min), et laver deux fois dans de l'eau distillée stérile. Reprendre le pel sporeslaisser dans l'eau distillée stérile et de la chaleur pendant 15 min à 78 ° C pour éliminer les bactéries végétatives restantes. Numerate la suspension en étalant des dilutions en série sur des plaques d'agar LB. Chaque larve recevra 10 ul de suspension de spores à la concentration souhaitée.

4. Préparation toxines Cry

  1. Préparer la toxine Cry1C de la B. 407 thuringiensis souche transformée par le plasmide pHTF31C 21 portant le gène codant pour Cry1C. Culture de la souche dans 100 ml milieu HCT à 30 ° C pendant 72 heures avec des antibiotiques (érythromycine 10mg/ml) afin de permettre la sporulation complète, la production de cristaux de toxine et de la libération dans le surnageant de culture.
  2. Purifier cristaux à partir du surnageant sur un gradient de saccharose à 79% de 72%. D'abord, ajoutez 17 ml de saccharose à 79% en un tube de 40 ml. Soigneusement couche 17 ml de sucrose 72% au-dessus de la saccharose 79%. Enfin, la couche de 5-6 ml de la culture sporulée 10X plus concentré et fermer le tube. Centrifuger le tube pendant 14 heures à 20,000 xg, 4 ° C, pour séparer les cristaux à partir des spores. Recueillir les cristaux à l'interface du gradient. Reprendre le culot de cristal dans 25 ml d'eau stérile froide pour le laver. Centrifuger à 8000 xg pendant 20 min. Cette étape est répétée trois fois pour éliminer toute saccharose coller aux cristaux. Remettre en suspension les cristaux dans 5 ml d'eau stérile et observer au microscope pour évaluer la pureté.
  3. Évaluer la concentration en protéines de toxines par coloration classique Bradford sur la solution de cristal presolubilized dans 50 mM de NaOH. Cristaux de toxine peut être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation.

5. Préparation injecteur

  1. Pour contrôler le volume d'injection précis, utiliser une pompe à seringue automatisée (par exemple KD Scientific KDS 100) avec une vitesse de configuration à 1 l / sec (figure 1A).
  2. Remplir une seringue de 1 ml hypodermique avec 300 pl d'eau ou de la solution bactérienne (1 seringue par condition) pour l'infection de 20-25 larves. Retirer les bulles en prenant soin de tapping la seringue, puis fixer une aiguille 0,45 x 12 mm à la seringue.
  3. Placer la seringue dans l'injecteur.
  4. Effectuer une injection de 10 ul vide dans un tube vide pour contrôler le volume injecté.

6. Insect injection Intrahaemocoelic

  1. Placez l'insecte manuellement entre le pouce et l'index. Ensuite, insérer l'aiguille fixée dans l'injecteur dans la peau larve (cuticule) (figure 1C).
  2. Gardez l'insecte en place lors de l'injection de 10 ul de solution bactérienne (bactéries ou spores végétatives).
  3. Retirez délicatement l'insecte de l'aiguille.
  4. Placez l'insecte infecté dans une petite boîte de Petri (5 cm de diamètre), 5 larves par boîte.
  5. Infecter au moins 20 larves pour chaque condition expérimentale.
  6. Placez les plats à 37 ° C dans un incubateur pendant 48 heures.

7. Le gavage des insectes (ingestion)

  1. Dans un tube Eppendorf de 2 ml, mélanger 0,2 pg / m &u; l de toxine Cry1C soit avec suspension cellulaire des spores ou végétative pour obtenir des concentrations finales allant de 3x10 4 à 1x10 7 pour 10 pl.
  2. Remplir une seringue de 1 ml avec une 30G, 25 mm aiguille hypodermique avec 300 ul de la solution de toxine bactérienne-Cry1C pour l'infection de 20-25 larves. Retirer les bulles de la seringue.
  3. Placez l'insecte manuellement de sorte que sa bouche entre l'aiguille fixée dans l'injecteur (figure 1D), et la force-feed avec 10 ul de la solution bactérienne à l'aide de la pompe à seringue automatisée.
  4. Infecter au moins 20 larves pour chaque condition expérimentale.
  5. Placez l'insecte infecté dans une petite boîte de Petri de 5 cm (5 larves par boîte). Placez les plats à 37 ° C dans un incubateur pendant 48 heures.

8. La mortalité des insectes d'enregistrement

  1. Après des expériences de gavage ou par injection, gardez les larves dans la boîte de Pétri sans nourriture à 25 ° C ou 37 ° C. Vérifiez larves mortality régulièrement sur une période de 48 heures. Larves mortes sont inertes et se tournent généralement noir (figure 1B).
  2. Les données de mortalité peuvent être analysées à l'aide du programme log-Probit 14. Ce programme teste la linéarité des courbes dose-mortalité et fournit des doses létales (DL 50). Alternativement, d'autres programmes, tels que Prism (Graph Pad), l'analyse de la survie ou de données sur la mortalité peuvent être utilisés.

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Representative Results

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Injection intra haemocoelic de bactéries dans G. mellonella s'est avéré très utile pour l'identification des facteurs de virulence de nombreuses traitant de dommages aux tissus et la résistance aux facteurs immunitaires innés de plusieurs agents pathogènes humains. A titre d'exemple, la figure 2A représente la mortalité des insectes après l'injection de doses différentes de B. bactéries cereus (type sauvage et des souches mutantes) 22. Figure 2B représente la survie des bactéries après l'infection de G. mellonella par Pseudomonas aeruginosa 4.

L'utilisation de Galleria comme un modèle d'infection par voie orale pour B. cereus et B. thuringiensis repose sur l'évaluation de l'effet synergique des bactéries végétatives ou de spores sur l'activité insecticide de la toxine Cry1C 10. Les larves sont sensibles à l'ingestion de spores / toxine mélange, mais ne sont que faiblement sensibles à l'ingestion de Cry1Toxine C seule. Les résultats de mortalité des larves de septicémie après que les bactéries ont atteint l'hémocèle suite à la rupture des barrières intestinales. Figure 3 représente la mortalité des larves après l'ingestion de cristaux et de type sauvage ou des souches mutantes de 10 bactéries Bacillus.

Quelques bactéries ont été testées pour l'infection orale dans la Galleria. Parmi les agents pathogènes humains testés, B. cereus avec la toxine Cry1C ont été les plus virulents pour G. mellonella après infection par voie orale 24. Cette méthode peut être utilisée pour contrôler l'infection / colonisation du tractus gastro-intestinal. En effet, comme le montre la figure 4, le tube digestif larve peut être extraite après l'infection, et les modifications de la cellule hôte ainsi que la colonisation bactérienne peut être visualisée sur coupes en paraffine histologiques. En outre, l'ingestion de bactéries fluorescentes peut être utilisé pour suivre la trajectoire et la pro colonisationCESS le long des différents compartiments de la larve. Enfin, l'expression spécifique d'un gène dans les différents compartiments d'insectes peuvent être contrôlés par microscopie fluorescente 25.

Figure 1
Figure 1. (A) automatisé pompe à seringue de l'injecteur. (B) Dead (en haut, en noir) et vivant (en bas, blanc) G. larves mellonella. (C) Les bactéries sont injectés dans le hémocèle de G. larves mellonella. (D) G. mellonella larves sont nourris de force avec une préparation bactérienne: l'aiguille pénètre dans la bouche des larves d'insectes.

Figure 2
Figure 2. Résultats après l'injection intra haemocoelic. (A) la virulence CwpFM contre G. 22 larves mellonella. Différentes concentrations de B. cereus wilde type D (Bt 407) et ΔcwpFM souches mutantes ont été inoculées dans la hémocèle de 20 G. larves mellonella. La mortalité a été enregistrée après 24 heures à 37 ° C. Évolution dans le temps (B) de Pseudomonas aeruginosa PA14 infection dans G. mellonella 4. Vingt-cinq bactéries par larve ont été injectés au temps zéro. Les larves ont été écrasés au point de temps après l'infection indiquée et les numérations bactériennes ont été déterminés par placage. Chaque point représente la moyenne et l'écart type des comptages bactériens à partir de 10 groupes de 10 larves. Les larves sont morts environ 48 heures après l'injection, lorsque les concentrations bactériennes atteint 10 9 / g.

Figure 3
Figure 3. Synergie des spores et des cristaux de toxine Cry1C comme une évaluation de la pathogénicité chez G. mellonella larves après ingestion par voie orale 10. G. larve mellonellae ont été infectées par voie orale avec soit des cristaux de toxine Cry1C (1 pg par larve), ou avec 10 6 B. spores thuringiensis, ou avec un mélange de toxine Cry1C et B. spores thuringiensis. La mortalité des larves a été évaluée après 48 heures à 25 ° C.

Figure 4
Figure 4 L'infection orale des larves:. Colonisation et la localisation tissulaire des bactéries. (A) 10 pl de solution de colorant bleu a été introduit par gavage dans la bouche d'un G. larve mellonella. La larve a été disséqué pour révéler l'intestin rempli avec le colorant bleu. (B) Un mélange de souche Bt 407 et la toxine Cry1C a été introduit dans G. larves mellonella par gavage. Après 24 heures, les larves étaient tout inclus en paraffine, coupés et fixés. Histologiques des coupes longitudinales ont été colorées (hématoxyline et éosine et Gram effort). La photographie microscope optique (400X) montre l'intestin (violet foncé) et le Bacillus coloration de Gram (violet foncé) localisée à la surface intestinale. (C) Un mélange de Bt 407-Gfp souche fluorescente et la toxine Cry1C a été introduit dans G. larves mellonella par gavage. Après 24 heures, les bactéries ont atteint l'hémocèle et le cadavre d'insecte est rempli avec B. cereus exprimant la protéine fluorescente verte. (D) Analyse de l'expression in vivo Ilsa 25. Les observations microscopiques par épifluorescence ont été réalisées sur B. cereus transportant pHT315-pilsA'gfp. Les bactéries ont été isolées à partir de la hémocèle des larves de 24 heures après l'infection orale morts. Les bactéries vertes indiquent l'expression de la GFP en raison de l'activation du promoteur Ilsa. Cela montre l'expression spécifique de ce gène (ILSA) lorsque les bactéries ont atteint l'hémocèle.

Film 1. Propagation de la solution dans l'intestin de l'insecte après administration orale ingérerion. 10 ul de solution de colorant bleu a été introduit par gavage dans la bouche de la larve de la pyrale du maïs, Ostrinia nubilalis européenne. Le colorant se remplit rapidement dans la lumière intestinale des larves d'insectes. Cliquez ici pour voir le film .

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Discussion

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L'utilisation d'insectes et en particulier au stade larvaire, comme des modèles d'infection de plusieurs agents pathogènes, devient fréquente. Un modèle de choix pour certains aspects est la drosophile (mouche du modèle) utilisés comme les adultes et 1,2 stade larvaire. Le lépidoptère insectes G. mellonella a également été utilisé principalement pour tester la virulence bactérienne par injection. L'avantage de tolérer des températures plus élevées (supérieures à 37 ° C) que chez la drosophile (maximum 25 ° C) est important lorsque des agents pathogènes de mammifères doivent être étudiés. Également la taille de la Galleria est plus commode pour l'étude de la cinétique de l'infection et des lésions tissulaires. Enfin, notre protocole décrit la possibilité d'utiliser Galleria d'infection par voie orale, ce qui est un avantage pour les études liées à l'appareil digestif. De même, le stade larvaire d'une autre grosse chenille, Manduca sexta, est utilisé pour étudier les infections par injection dans le hémocèle et plus récemment pour l'infection orale 26.B. mori et des espèces Spodoptera, qui génomes sont séquencés 27 également offrir des alternatives intéressantes et gènes de l'hôte peut être arrêté par des méthodes ou des manipulations génétiques ARNi autres 28. Ici, nous décrivons d'une manière simple, comment élever les larves de Galleria, la façon de les infecter et quelques exemples sur la façon de suivre le processus d'infection et de mortalité partition afin de montrer le potentiel de ces modèles.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Elisabeth Guillemet, Christophe Buisson et Ludovic Bridoux pour l'assistance technique excellente. Nous sommes très reconnaissants à Sylvie Salamitou et Sinda Fedhila pour la configuration initiale du système.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

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L&#39;insecte<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Comme un modèle d&#39;infection puissant pour étudier la pathogenèse bactérienne
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Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).More

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).

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