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Immunology and Infection

O inseto doi: 10.3791/4392 Published: December 11, 2012

Summary

Oral e intra infecção haemocolic de larvas de traça da cera

Abstract

O estudo da virulência bacteriana requer frequentemente um modelo animal adequado. Modelos de mamíferos de infecção são caros e pode levantar questões éticas. O uso de insetos como modelos de infecção proporciona uma alternativa valiosa. Comparado com outros hospedeiros não vertebrados modelo tais como nemátodos, insectos têm um sistema relativamente avançado de defesas antimicrobianas e são por isso mais susceptíveis de produzir a informação relevante para o processo de infecção de mamíferos. Como mamíferos, insetos possuem um sistema complexo imune inata 1. As células na hemolinfa são capazes de encapsular ou fagocitando invasores microbianos, e as respostas humorais incluem a produção induzida de lisozima e pequenos péptidos antibacterianos 2,3. Além disso, as analogias são encontrados entre as células epiteliais do intestino médio de insectos e larvas de células intestinais de sistemas digestivo de mamíferos. Por fim, vários componentes básicos essenciais para o processo de infecção bacteriana, como a adesão celular, a resistência àpéptidos antimicrobianos, a degradação do tecido e de adaptação ao stress oxidativo são susceptíveis de ser importante, em ambos os insectos e mamíferos 1. Assim, os insectos são ferramentas polivalentes para a identificação e caracterização de factores de virulência microbianas envolvidas em infecções de mamíferos.

As larvas de traça da cera maior Galleria mellonella foram mostrados para fornecer uma visão útil para a patogénese de uma grande variedade de infecções microbianas, incluindo fungos de mamíferos (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) e os agentes patogénicos bacterianos, tais como Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes ou Enterococcus faecalis 4-7. Independentemente das espécies bacterianas, os resultados obtidos com Galleria larvas infectadas por injecção directa através da cutícula consistentemente correlacionados com aqueles de simiLar estudos de mamíferos: estirpes de bactérias que são atenuadas em modelos de mamíferos demonstram menor virulência em Galleria, e as tensões que causam graves infecções humanas são também altamente virulenta no modelo Galleria 8-11. A infecção oral de Galleria é muito menos utilizada e adicional de compostos, como as toxinas específicas, são necessárias para atingir a mortalidade.

Larvas de G. mellonella apresentam várias vantagens técnicas: são relativamente grandes (larvas de último estádio antes pupação são cerca de 2 cm de comprimento e de peso mg 250), permitindo assim a injecção de doses definidas de bactérias, podem ser criados em várias temperaturas (20 ° estudos C a 30 ° C) e a infecção pode ser realizada entre 15 ° C e acima de 37 ° C 12,13, permitindo experiências que simulam um ambiente de mamíferos. Além disso, a criação de insetos é fácil e relativamente barato. Infecção das larvas permite monitorar a virulência bacteriana por vários meios, including cálculo de LD 50 14, a medida de sobrevivência bacteriana 15,16 e exame do processo de infecção 17. Aqui, descrevemos a criação dos insetos, abrangendo todas as fases de vida de G. mellonella. Nós fornecemos um protocolo detalhado de infecção por duas vias de inoculação: haemocoelic oral e intra. O modelo bacteriano utilizado no presente protocolo é uma Bacillus cereus, de agentes patogénicos Gram-positivos implicada na gastrointestinal, bem como em outros locais ou sistémicas graves infecções oportunistas 18,19.

Protocol

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1. A criação de insetos

O ciclo completo de ovo a larva de último estádio dura cerca de 5 semanas a 25 ° C. Uma ou duas semanas adicionais são necessários para obter as borboletas adultas.

  1. Coloque pelo menos 100 pupas ou recém-fundidas adulto G. borboletas mellonella em 5 litros de gaiola de arame. Borboletas masculinos avaliar 10 a 15 mm. A mariposa adulta masculina é bege com luz fraca e marcas escuras. Medida borboletas fêmeas em torno de 20 mm. As fêmeas são mais escuras do que os homens com uma cor marrom / cinza.
  2. Suspender dois maços de quatro camadas de papel na gaiola para postura de ovos. Após 2 dias, a fêmea adulta põe ovos no limite entre os papéis.
  3. Duas vezes por semana, coloque os pacotes de ovo de papel em novas caixas de criação de plástico com grades para circulação de ar, contendo pólen e cera de abelha. Os ovos eclodem em cerca de 3 dias e pequenas larvas começam a se desenvolver através da alimentação em cera e pólen. Alternativamente, as larvas podem ser colocados em uma dieta artificial consisting de uma mistura de 500 g de mel líquido, 400 g de glicerina, 100 g de levedura de cerveja seca, 250 g de farinha de trigo, 200 g de leite em pó desnatado e 400 g polenta. Para proporcionar proporção adequada de alimento por larva, regularmente separar as larvas em caixas novas e reconstituir o alimento a cada dois dias.
  4. As larvas são criados durante as seis fases de larva estádio. Cada estádio é caracterizado por o deslizamento da cápsula da cabeça de larvas. Quando as larvas atingem o último estágio antes pupação, eles param de alimentação e começar a construir um casulo de seda luz.
  5. Em seus casulos protetores, as larvas vai descansar e se transformam em pupas. Worms cera permanecem na fase de pupa de uma a duas semanas para emergir em traças adultas. As mariposas adultas não beber nem comer. O acasalamento ocorre e ciclo dos vermes de cera "a vida começa de novo.
  6. Para padronizar o ensaio de patologia, tomar a larvas durante o último estágio larval. Durante esta fase, eles param de alimentação, mudar-se para a tampa da caixa de criação e começar a produzir seda. Este stage dura cerca de 5 dias.

2. Seleção de inseto para a Infecção

  1. Selecione larvas no último instar, que são 2-3 cm de comprimento e 180-250 mg de peso, 24 horas antes de infecções e colocá-los em uma caixa vazia para privá-los.
  2. Remover o casulo de seda em torno da nascente larvas.

3. Preparação bacteriana

  1. Preparar suspensões bacterianas de Bacillus para se obter concentrações finais que variam de 10 4 unidades formadoras de colónias (ufc) / ml a 10 8 ufc / ml para injecção intra haemocoelic e de 3x10 6 ufc / ml para 1x10 8 ufc / ml para ingestão (a cfu obter um LD 50 depende das espécies de bactérias). No nosso caso, B. cereus é cultivada em meio Luria-Bertani broth (LB, 10 g / l de triptona, 5 g de extracto de levedura / l, 10 g / l NaCl) a 37 ° C, sob agitação, até à entrada em fase estacionária, que corresponde ao curvamento do crescimento curva. Medir o OD 600 nm (entre 1 e 2 para a B. cereus) e utilizá-la para determinar a concentração de bactérias, utilizando uma curva de titulação anteriormente feita. Colheita bactérias por centrifugação a 5000 xg durante 10 min à temperatura ambiente e ressuspender em tampão fosfato salino (PBS: 1M KH 2 PO 4, 1 M K 2 HPO 4, NaCl 5 M, pH 7,2). Cada larva receberá 10 ul de suspensão bacteriana na concentração desejada.
  2. Em alternativa, a suspensão de esporos, podem ser preparados por infecção. Obter esporos por cultura das bactérias na esporulação meio HCT (5 g / L de triptona, 2 g / L de hidrolisado de caseína, 12,5 mM de K 2 HPO 4, 12,5 mM de MgSO4, 0,05 mM MnSO4, 1,2 mM de ZnSO 4, 1,2 mM Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% de H 2 SO 4, 25 mM de CaCl 2) 20 a 30 ° C durante 3 dias. Esporos de colheita por centrifugação (10.000 xg, 15 min), e lavar duas vezes em água destilada estéril. Ressuspender o pel esporosdeixar em água destilada estéril e calor durante 15 min a 78 ° C para remover o restante bactérias vegetativas. Numerar a suspensão através do plaqueamento de diluições em série em placas de agar LB. Cada larva receberá 10 ul de suspensão de esporos para a concentração desejada.

4. Cry Preparação Toxina

  1. Preparar a toxina do B. Cry1C thuringiensis 407 transformado com o plasmídeo pHTF31C 21 transportando o gene que codifica Cry1C. Cultura da estirpe em meio HCT 100 ml a 30 ° C durante 72 horas com antibiótico (eritromicina 10mg/ml) para permitir a esporulação total, a produção de toxina de cristal e da libertação no sobrenadante da cultura.
  2. Purifica-se cristais a partir do sobrenadante em um gradiente de sacarose de 72% -79%. Primeiro adicione 17 ml de sacarose de 79% em um tubo de 40 ml. Cuidadosamente camada de 17 ml de 72% de sacarose em cima de sacarose a 79%. Finalmente, a camada de 5-6 ml da cultura concentrada 10X esporulado e fechar o tubo. Centrifugar o tubo durante 14 horas a 20,000 xg, 4 ° C, para separar os cristais a partir dos esporos. Recolher os cristais na interface do gradiente. Ressuspender o sedimento em 25 ml de cristais de água fria estéril para lavá-la. Centrifugar a 8.000 xg durante 20 min. Este passo é repetido três vezes para remover todos sacarose aderindo aos cristais. Ressuspender os cristais em 5 ml de água estéril e observar ao microscópio para avaliação da pureza.
  3. Avaliar a concentração de proteína toxina pelo clássico coloração Bradford em solução de cristal presolubilized em 50 mM NaOH. Cristais de toxina podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.

5. Injector Preparação

  1. Para controlar o volume de injecção de precisão, utilizar uma bomba de seringa automatizada (por exemplo KD Scientific KDS 100) com uma velocidade de instalação para 1 ^ l / s (Figura 1A).
  2. Encher uma seringa hipodérmica uma com 300 ml de água ou ul da solução bacteriana (uma seringa por condição) para a infecção de larvas de 20-25. Remover cuidadosamente as bolhas por tapping a seringa, em seguida, juntar uma agulha 0,45 x 12 mm para a seringa.
  3. Colocar a seringa no injector.
  4. Realizar uma injecção de 10 ul em branco em um tubo vazio para controlar o volume injectado.

6. Injeção Intrahaemocoelic inseto

  1. Coloque o inseto manualmente entre o polegar eo indicador. Em seguida, inserir a agulha fixada no injector na pele larva (cutícula) (Figura 1C).
  2. Mantenha o inseto no local, enquanto injetar a solução de 10 ul bacteriana (bactérias ou esporos vegetativo).
  3. Remova cuidadosamente o inseto da agulha.
  4. Coloque o insecto infectado em um prato de Petri pequenas (5 cm de diâmetro), 5 larvas por placa.
  5. Infectar pelo menos 20 larvas para cada condição experimental.
  6. Colocar as placas a 37 ° C numa incubadora durante 48 horas.

7. Alimentação Força inseto (Ingestão)

  1. Num tubo Eppendorf 2 ml, misturar 0,2 ug / & mu, l de toxina Cry1C quer com suspensão de esporos ou células vegetativas para obter concentrações finais que variam de 4 a 3x10 1x10 7 por 10 ul.
  2. Encher uma seringa de 1 ml com uma 30G, 25 mm, com agulha hipodérmica de 300 ul da solução de toxina bacteriana, Cry1C na infecção de larvas de 20-25. Remover as bolhas a partir da seringa.
  3. Coloque o insecto manualmente, de modo que a sua boca entra na agulha fixa no injector (Figura 1D), e da força de alimentá-la com 10 ul da solução bacteriana usando a bomba de seringa automatizada.
  4. Infectar pelo menos 20 larvas para cada condição experimental.
  5. Coloque o inseto infectado em um pequeno 5 centímetros de Petri (5 larvas por prato). Colocar as placas a 37 ° C numa incubadora durante 48 horas.

8. Mortalidade dos insetos gravação

  1. Depois de experiências de alimentação forçada ou injecção, manter as larvas na placa de Petri, sem comida, a 25 ° C ou 37 ° C. Verifique larval mortality regularmente ao longo de um período de 48 h. Larvas mortas são inertes e, geralmente, ficam pretas (Figura 1B).
  2. Os dados de mortalidade pode ser analisado utilizando o programa de log-probit 14. Este programa testa a linearidade das curvas de mortalidade de dose e fornece doses letais (LD 50). Alternativamente, outros programas, tais como o Prism (Graph Pad), análise de sobrevivência ou dados de mortalidade pode ser usado.

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Representative Results

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Injecção intra haemocoelic de bactérias em G. mellonella foi provado muito útil para a identificação de factores de virulência muitas tratam de danos nos tecidos e a resistência a factores imunes inatas de vários agentes patogénicos humanos. Como exemplo, a figura 2A representa a mortalidade de insectos após a injecção de várias doses de B. cereus (bactérias de tipo selvagem e estirpes mutantes) 22. Figura 2B representa a sobrevivência após a infecção bacteriana de G. mellonella por Pseudomonas aeruginosa 4.

O uso de Galleria como um modelo de infecção oral para B. cereus e B. thuringiensis baseia-se na avaliação do efeito sinérgico das bactérias vegetativas ou esporos sobre a actividade insecticida da toxina Cry1C 10. As larvas são suscetíveis à ingestão de esporos / toxina mistura, mas são apenas pouco suscetíveis à ingestão de Cry1C toxina sozinha. Os resultados de mortalidade de larvas de septicemia após bactérias atingiram a hemocele após a ruptura das barreiras intestinais. Figura 3 representa a mortalidade larval após a ingestão de cristais e, ou de tipo selvagem ou mutantes de bactérias Bacillus 10.

Poucas bactérias foram testadas para a infecção por via oral em Galleria. Entre os agentes patogénicos humanos testados, B. cepas cereus com toxina Cry1C foram os mais virulentos para G. mellonella após infecção oral 24. Este método pode ser utilizado para monitorizar a infecção / colonização do tracto gastro intestinal. Com efeito, como mostrado na Figura 4, o aparelho digestivo larva pode ser extraído depois de infecção, e as modificações da célula hospedeira, assim como a colonização bacteriana pode ser visualizado em secções de parafina histológicas. Além disso, a ingestão de bactérias fluorescentes podem ser usados ​​para seguir a trajectória e a pro colonizaçãocesso ao longo dos diferentes compartimentos das larvas. Finalmente, a expressão de um gene específico em diferentes compartimentos de insectos pode ser monitorizada por microscopia fluorescente 25.

Figura 1
Figura 1. (A) Automated seringa bomba injectora. (B) Dead (topo, preto) e vivo (parte inferior, branco) G. larvas mellonella. (C) As bactérias são injetados na hemocele de G. larvas mellonella. (D) G. mellonella larvas são alimentados à força com preparação bacteriana: a agulha entra na boca das larvas de insetos.

Figura 2
Figura 2. Resultados após a injeção intra haemocoelic. (A) virulência CwpFM contra G. larvas mellonella 22. Várias concentrações de B. cereus wild-tipo (Bt 407) e estirpes mutantes ΔcwpFM foram inoculadas na hemocele de 20 G. larvas mellonella. A mortalidade foi registada após 24 h a 37 ° C. (B) curso Tempo de Pseudomonas aeruginosa PA14 em G. mellonella 4. Vinte e cinco bactérias por larva foram injectados no tempo zero. As larvas foram esmagados no tempo indicado pontos pós-infecção e as contagens bacterianas foram determinadas por plaqueamento. Cada ponto de dados representa a média e desvio padrão de contagens de bactérias a partir de 10 grupos de 10 larvas. Larvas morreram aproximadamente 48 horas após a injecção, quando as concentrações bacterianas atingiu 10 9 / g.

Figura 3
Figura 3. Sinergismo de esporos e cristais de toxina cry1C como uma avaliação da patogenicidade em G. larvas mellonella após a ingestão oral 10. G. larva mellonellae foram infectados oralmente quer com cristais de toxina Cry1C (1 ug por larva), ou com 10 6 B. esporos thuringiensis, ou com uma mistura de toxina Cry1C e B. esporos thuringiensis. A mortalidade das larvas foi avaliada após 48 horas a 25 ° C.

Figura 4
Figura 4 A infecção oral de larvas:. Colonização e localização dos tecidos das bactérias. (A) 10 ul de solução de corante azul foi introduzido pela força de alimentação para dentro da boca de um G. larva mellonella. A larva foi dissecada para revelar o intestino cheio com o corante azul. (B) Uma mistura de 407 e estirpe Bt toxina Cry1C foi introduzido em G. larvas mellonella por alimentação forçada. Após 24 horas, as larvas todo foram incluídos em parafina, cortados e fixados. Histológicas secções longitudinais foram coradas (Hematoxilina & Eosina e Gram esforço). A fotografia microscópica de luz (400X) mostra o intestino (roxo escuro) e o Bacillus Gram (violeta escuro) localizados na superfície intestinal. (C) Uma mistura de 407-Bt Gfp estirpe fluorescente e toxina Cry1C foi introduzido em G. larvas mellonella por alimentação forçada. Após 24 horas, as bactérias atingiram a hemocele e insecto do cadáver é preenchido com B. cereus que expressam a proteína verde fluorescente. (D) Análise de expressão Ilsa in vivo 25. As observações microscópicas de epifluorescência foram realizados em B. cereus transportando pHT315-pilsA'gfp. As bactérias foram isoladas a partir do hemocelo de larvas mortas hr 24 após infecção oral. Bactérias verdes indicam expressão de gfp devido à ativação do promotor Ilsa. Isto demonstra a expressão deste gene específico (ILSA) quando as bactérias atingiram a hemocele.

Filme 1. Divulgação de solução no intestino do inseto após ingerir por via oralíon. 10 ul de uma solução de corante azul foi introduzido pela força de alimentação para dentro da boca da broca do milho europeu Ostrinia nubilalis larva. O corante rapidamente preenche o lúmen intestinal das larvas de insetos. Clique aqui para ver filme .

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Discussion

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O uso de insetos e principalmente o estágio larval, como modelos de infecção por vários patógenos, está se tornando freqüente. Um modelo de escolha para alguns aspectos é Drosophila (o modelo mosca), utilizado como adultos e 1,2 estágio larval. O inseto lepidóptero G. mellonella também tem sido principalmente utilizado para o ensaio de virulência bacteriana por injecção. A vantagem de tolerar temperaturas mais elevadas (acima de 37 ° C) do que a Drosophila (máximo 25 ° C), é importante quando são agentes patogénicos de mamíferos a ser estudado. Além disso, o tamanho de Galleria é mais conveniente para estudar a cinética da infecção e danos nos tecidos. Finalmente, o nosso protocolo descreve a possibilidade de utilizar para Galleria infecção oral, o que é uma vantagem para os estudos relacionados com o tracto digestivo. Do mesmo modo, a fase larval da outra lagarta grande, Manduca sexta, é usado para estudar as infecções por injecção no hemocele e, mais recentemente, para a infecção por via oral 26.B. mori e espécies de Spodoptera, que genomas seqüenciados são 27 também oferecer alternativas interessantes, e genes do hospedeiro pode ser desligado por meio de métodos de RNAi ou manipulações genéticas outros 28. Aqui, nós descrevemos de uma forma simples, como para elevar Galleria larvas, como infectá-las e alguns exemplos de como seguir o processo de infecção e mortalidade contagem, a fim de demonstrar o potencial de tais modelos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer Elisabeth Guillemet, Christophe Buisson e Ludovic Bridoux para assistência técnica excelente. Temos uma grande dívida para Sylvie Salamitou e Fedhila Sinda para a configuração inicial do sistema.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

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References

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O inseto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana
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Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).More

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).

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