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Immunology and Infection

El insecto doi: 10.3791/4392 Published: December 11, 2012

Summary

Haemocolic infección intra oral y de las larvas de la polilla mayor de la cera

Abstract

El estudio de la virulencia bacteriana a menudo requiere un modelo animal adecuado. Modelos de mamíferos de infección son costosos y pueden plantear cuestiones éticas. El uso de insectos como modelos de infección proporciona una alternativa valiosa. En comparación con otros anfitriones modelo no vertebrados tales como los nematodos, insectos tienen un sistema relativamente avanzado de defensas antimicrobianas y por tanto son más propensos a producir información relevante para el proceso de infección de mamífero. Al igual que los mamíferos, los insectos poseen un complejo sistema inmune innato 1. Las células en la hemolinfa son capaces de fagocitar o encapsular los invasores microbianos, y las respuestas humorales incluyen la producción inducible de los péptidos antibacterianos de lisozima y 2,3 pequeño. Además, las analogías se encuentran entre las células epiteliales del intestino medio de larvas de insectos y células intestinales de los sistemas digestivos de mamíferos. Finalmente, varios componentes básicos esenciales para el proceso de infección bacteriana, como la adhesión celular, la resistencia apéptidos antimicrobianos, la degradación del tejido y la adaptación al estrés oxidativo es probable que sean importantes tanto en los insectos y mamíferos 1. Así, los insectos son herramientas polivalentes para la identificación y caracterización de factores de virulencia microbianos implicados en las infecciones de mamíferos.

Las larvas de la polilla mayor de la cera Galleria mellonella se ha demostrado que proporcionan una información útil sobre la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas, incluyendo hongos de mamífero (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) y los patógenos bacterianos, tales como Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes o Enterococcus faecalis 4-7. Independientemente de las especies bacterianas, los resultados obtenidos con larvas de Galleria infectados por inyección directa a través de la cutícula se correlaciona necesariamente con los de Similar estudios de mamíferos: las cepas bacterianas que son atenuados en modelos de mamíferos demostrar menor virulencia en Galleria, y las cepas que causan graves infecciones humanas son también altamente virulento en el modelo Galleria 8-11. Infección oral de la Galleria es mucho menos utilizado y otros compuestos, como toxinas específicas, son necesarios para llegar a la mortalidad.

G. mellonella larvas presentes varias ventajas técnicas: son relativamente grandes (larvas de último estadio antes de la pupación son aproximadamente 2 cm de largo y mg de peso 250), lo que permite la inyección de dosis definidas de bacterias, ya que pueden ser criados a diversas temperaturas (20 ° estudios C a 30 ° C) y la infección puede llevarse a cabo entre 15 ° C a 37 ° C por encima de 12,13, lo que permite experimentos que imitan un entorno de mamífero. Además, la cría de insectos es fácil y relativamente barato. La infección de las larvas permite monitorizar la virulencia bacteriana por varios medios, including cálculo de LD 50 14, la medición de la supervivencia bacteriana 15,16 y el examen del proceso de infección 17. Aquí se describe la cría de los insectos, que cubre todas las etapas de vida de G. mellonella. Proporcionamos un protocolo detallado de la infección por dos vías de inoculación: haemocoelic intravaginal. El modelo bacteriano utilizado en este protocolo es Bacillus cereus, un patógeno Gram positivo implicado en gastrointestinal, así como en otras infecciones oportunistas graves local o sistémica 18,19.

Protocol

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1. La cría de insectos

El ciclo completo de huevo a larvas de último estadio dura alrededor de 5 semanas a 25 ° C. Una o dos semanas adicionales son necesarios para obtener las mariposas adultas.

  1. Coloque por lo menos 100 pupas o adultos recién fusionada G. mariposas mellonella en un 5-litros de malla de alambre jaula. Mariposas macho medir 10 a 15 mm. La polilla macho adulto es de color beige con luz tenue y marcas oscuras. Mariposas medida Femenino alrededor de 20 mm. Las hembras son más oscuras que los machos con un color marrón / gris.
  2. Suspender dos paquetes de cuatro capas de papel en la jaula para la puesta de huevos. Después de 2 días, la hembra adulta se ponen los huevos en el borde entre los papeles.
  3. Dos veces por semana, coloque los paquetes de papel de huevo en las nuevas cajas de crianza de plástico con rejillas para que el aire circule, que contiene polen y cera de abeja. Los huevos eclosionan en unos 3 días y pequeñas larvas comienzan a desarrollarse alimentándose de cera y polen. Alternativamente, larvas se colocan sobre una dieta artificial consisting de una mezcla de miel líquida 500 g, 400 g de glicerina, 100 g de levadura de cerveza seca, harina de trigo 250 g, 200 g de leche en polvo descremada y 400 g polenta. Proporcionar proporción adecuada de alimento por larvas, regularmente separar las larvas en cajas nuevas y reponer la comida cada dos días.
  4. Las larvas se crían durante las seis etapas del estadio de larva. Cada estadio se caracteriza por el deslizamiento de la cápsula de la cabeza de las larvas. Cuando las larvas alcanzan la última etapa antes de la pupación, dejan de alimentarse y empezar a construir un capullo de seda.
  5. En sus capullos protectores, las larvas se apoyará y se transforman en pupas. Gusanos de cera permanecerá en la fase de pupa de una a dos semanas para emerger en polillas adultas. Las polillas adultas no beber ni comer. El apareamiento se produce y el ciclo de los gusanos de cera "la vida comienza de nuevo.
  6. Para estandarizar el ensayo de patología, tomar las larvas durante la etapa larval pasado. Durante esta etapa dejan de alimentarse, moverse a la tapa de la caja de la cría y empezar a producir seda. Este stage dura alrededor de 5 días.

2. Selección de insectos para la infección

  1. Seleccione último estadio larvario, que son de 2-3 cm de largo y 180-250 mg de peso, 24 horas antes de las infecciones y los puso en una caja vacía a morir de hambre.
  2. Quitar el capullo de seda alrededor de la naciente larvas.

3. Preparación bacteriana

  1. Preparar suspensiones bacterianas de Bacillus para obtener concentraciones finales que varían desde 10 4 unidades formadoras de colonias (ufc) / ml a 10 8 ufc / ml para inyección intra haemocoelic y de 3x10 6 ufc / ml a 1x10 8 ufc / ml para la ingestión (el ufc para obtener un LD 50 depende de la especie bacteriana). En nuestro caso, B. cereus se cultiva en medio Luria-Bertani caldo (LB, 10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto de levadura, 10 g / l de NaCl) a 37 ° C bajo agitación hasta que la entrada en fase estacionaria, correspondiente a la incurvación del crecimiento curva. Mida las OD 600 nm (entre 1 y 2 por B. cereus) y se utilizan para evaluar la concentración bacteriana, utilizando una curva de valoración previamente hecha. Cosecha bacterias por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a temperatura ambiente y se resuspende en tampón fosfato salino (PBS: 1 M KH 2 PO 4, 1M K 2 HPO 4, 5 M NaCl, pH 7,2). Cada larva recibirá 10 l de suspensión bacteriana en la concentración deseada.
  2. Alternativamente, la suspensión de esporas se pueden preparar para la infección. Obtener esporas cultivando las bacterias en el medio de esporulación HCT (5 g / L de triptona, 2 g / L de hidrolizado de caseína, 12,5 mM K 2 HPO 4, 12,5 mM MgSO 4, 0,05 mM MnSO 4, 1,2 mM de ZnSO 4, 1,2 mM Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% H 2 SO 4, 25 mM CaCl 2) 20 a 30 ° C durante 3 días. Esporas cosecha por centrifugación (10.000 xg, 15 min) y lavar dos veces en agua destilada estéril. Resuspender el pel esporasdejar en agua destilada estéril y calor durante 15 min a 78 ° C para eliminar el resto de las bacterias vegetativas. Numerate la suspensión mediante siembra de diluciones seriadas en placas de agar LB. Cada larva recibirá 10 l de suspensión de esporas a la concentración deseada.

4. Preparación de toxina Cry

  1. Preparar la toxina Cry1C de la B. thuringiensis cepa 407 transformada con el plásmido 21 pHTF31C llevar el gen que codifica Cry1C. Cultivar la cepa en medio HCT 100 ml a 30 ° C durante 72 horas con antibióticos (eritromicina 10mg/ml) para permitir la esporulación completa, la producción de toxina de cristal y la liberación en el sobrenadante del cultivo.
  2. Purificar cristales del sobrenadante en un gradiente de sacarosa 72% -79%. En primer lugar añadir 17 ml de 79% de sacarosa en un tubo de 40 ml. Cuidadosamente capa 17 ml de 72% de sacarosa en la parte superior de la sacarosa del 79%. Finalmente, la capa de 5-6 ml del cultivo esporulado concentrado 10 veces y cerrar el tubo. Se centrifuga el tubo durante 14 horas a 20,000 xg, 4 º C, para separar los cristales de las esporas. Recoger los cristales en la interfaz de gradiente. Resuspender el precipitado de cristales en 25 ml de agua estéril fría para lavar. Centrifugar a 8.000 xg durante 20 min. Este paso se repitió tres veces para eliminar todo sacarosa se pegue a los cristales. Resuspender los cristales en 5 ml de agua estéril y observar al microscopio para evaluar la pureza.
  3. Evaluar la concentración de toxina de proteína por tinción clásica Bradford en solución de cristal presolubilized en 50 mM NaOH. Cristales de toxina puede ser almacenado a -20 ° C hasta su uso.

5. Inyector de Preparación

  1. Para controlar el volumen de inyección precisa, utilizar una bomba de jeringa automatizada (por ejemplo, KD Scientific KDS 100) con una velocidad de configuración a 1 l / seg (Figura 1A).
  2. Llene una jeringa de 1 ml hipodérmica con 300 l de agua o la solución bacteriana (1 jeringa por condición) para la infección de larvas de 20-25. Eliminar las burbujas con cuidado tapping la jeringa, después coloque un 0,45 x 12 mm aguja a la jeringa.
  3. Coloque la jeringa en el inyector.
  4. Realizar una inyección en blanco de 10 l en un tubo de vacío para controlar el volumen inyectado.

6. Inyección Intrahaemocoelic insectos

  1. Coloque el insecto manualmente entre el pulgar y el índice. A continuación, insertar la aguja fijada en el inyector en la piel larva (cutícula) (Figura 1C).
  2. Mantenga el insecto en su lugar mientras se inyecta la solución 10 l bacteriana (bacterias o esporas vegetativo).
  3. Retire con cuidado el insecto de la aguja.
  4. Coloque el insecto infectado en una pequeña placa de Petri (5 cm de diámetro), 5 larvas por plato.
  5. Infect al menos 20 larvas para cada condición experimental.
  6. Colocar las cápsulas a 37 º C en una incubadora durante 48 hr.

7. La alimentación forzada de insectos (Ingestión)

  1. En un tubo Eppendorf de 2 ml, mezclar 0,2 g / & mu; l de la toxina Cry1C con cualquiera de suspensión de células o esporas vegetativo para obtener concentraciones finales que van desde 3x10 a 1x10 4 7 por 10 l.
  2. Llene una jeringa de 1 ml con un 30 G, 25 mm aguja hipodérmica con 300 l de la solución de toxina bacteriana-Cry1C en la infección de larvas de 20-25. Eliminar las burbujas de la jeringa.
  3. Coloque el insecto manualmente de modo que su boca entra en la aguja fija en el inyector (Figura 1D), y alimentar a la fuerza con 10 l de la solución bacteriana usando la bomba de jeringa automatizada.
  4. Infect al menos 20 larvas para cada condición experimental.
  5. Coloque el insecto infectado en un pequeño plato Petri de 5 cm (5 larvas por plato). Colocar las cápsulas a 37 º C en una incubadora durante 48 hr.

8. Grabación de la mortalidad de insectos

  1. Después de los experimentos de alimentación forzada o de inyección, mantener las larvas en la placa de Petri sin alimento a 25 ° C o 37 ° C. Compruebe larval mortality regularmente durante un período de 48 horas. Larvas muertas son inertes y por lo general vuelve negro (fig. 1B).
  2. Los datos de mortalidad se pueden analizar utilizando el programa de log-probit 14. Este programa pone a prueba la linealidad de las curvas de mortalidad de dosis y proporciona dosis letales (LD 50). Alternativamente, otros programas, tales como Prism (Graph Pad), analizando la supervivencia o los datos de mortalidad se puede utilizar.

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Representative Results

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Inyección Intra haemocoelic de bacterias en G. mellonella ha demostrado ser muy útil para la identificación de factores de virulencia que se ocupan de los daños y la resistencia a los factores inmunes innatas de varios patógenos humanos. Como ejemplo, la figura 2A representa mortalidad de los insectos después de la inyección de varias dosis de B. bacterias cereus (tipo salvaje y cepas mutantes) 22. Figura 2B representa la supervivencia bacteriana después de la infección de G. mellonella por Pseudomonas aeruginosa 4.

El uso de Galleria como un modelo de infección oral por B. cereus y B. thuringiensis basa en la evaluación del efecto sinérgico de las bacterias vegetativas o esporas sobre la actividad insecticida de la toxina Cry1C 10. Las larvas son susceptibles a la ingestión de la mezcla esporas / toxina pero son sólo débilmente susceptibles a la ingestión de Cry1C de la toxina sola. Los resultados de mortalidad de larvas de septicemia después de las bacterias han alcanzado la haemocoel tras la ruptura de las barreras intestinales. Figura 3 representa la mortalidad larval después de la ingestión de los cristales y de tipo salvaje o cepas mutantes de bacterias Bacillus 10.

Pocas bacterias han sido probados para la infección oral en Galleria. Entre los patógenos humanos probados, B. cepas cereus con toxina Cry1C fueron los más virulentos para G. mellonella después de la infección oral de 24. Este método puede ser usado para monitorear la infección / colonización del tracto gastro intestinal. En efecto, como se muestra en la Figura 4, el tracto digestivo larva se puede extraer después de la infección, y las modificaciones de la célula huésped, así como la colonización bacteriana puede ser visualizado en secciones de parafina histológicos. Además, la ingestión de las bacterias fluorescentes se pueden utilizar para seguir la trayectoria y la pro colonizaciónceso a lo largo de los diferentes compartimentos de las larvas. Finalmente, la expresión específica de un gen en los compartimentos diferentes de insectos puede ser monitoreada por microscopía fluorescente 25.

Figura 1
Figura 1. (A) Automated bomba de jeringa del inyector. (B) Dead (top, negro) y vivos (abajo, blanco) G. mellonella larvas. (C) Las bacterias se inyectan en el hemocelo de G. mellonella larvas. (D) G. larvas mellonella son alimentados a la fuerza con la preparación bacteriana: la aguja entra en la boca de las larvas de insectos.

Figura 2
Figura 2. Resultados después de la inyección intra haemocoelic. (A) CwpFM virulencia contra G. mellonella larvas 22. Varias concentraciones de B. cereus wild-tipo (Bt 407) y las cepas mutantes ΔcwpFM se inocularon en el hemocelo de 20 G. mellonella larvas. Se registró la mortalidad después de 24 horas a 37 ° C. (B) Evolución temporal de Pseudomonas aeruginosa PA14 infección en G. mellonella 4. Veinticinco bacterias por larva se inyectaron en el tiempo cero. Las larvas fueron aplastados en el momento indicado puntos después de la infección y los recuentos bacterianos se determinaron mediante chapado. Cada punto de datos representa la media y la desviación estándar de los recuentos bacterianos de 10 lotes de 10 larvas. Las larvas murieron aproximadamente 48 horas después de la inyección, cuando las concentraciones bacterianas alcanzó 10 9 / g.

Figura 3
Figura 3. Sinergismo de esporas y cristales Cry1C toxina como una evaluación de la patogenicidad en G. mellonella larvas después de la ingestión oral 10. G. mellonella larvae fueron infectados por vía oral con cristales de toxina Cry1C (1 g por larva), o con 10 6 B. esporas thuringiensis, o con una mezcla de toxina Cry1C y B. esporas thuringiensis. Mortalidad de las larvas se evaluó después de 48 horas a 25 ° C.

Figura 4
Figura 4 La infección oral de larvas:. Colonización y la localización tisular de las bacterias. (A) 10 l de solución de colorante azul fue introducido por la alimentación forzada en la boca de un G. mellonella larva. La larva se diseccionó para revelar el intestino lleno con el colorante azul. (B) Una mezcla de Bt cepa 407 y toxina Cry1C se introdujo en G. mellonella larvas de la alimentación forzada. Después de 24 horas, larvas enteras fueron embebidos en parafina, cortado y arreglado. Histológicas se tiñeron secciones longitudinales (hematoxilina y eosina, y extendiéndome Gram). La fotografía de microscopía óptica (400X) muestra el intestino (morado oscuro) y el bacilo Gram manchado (violeta oscuro) localizadas en la superficie intestinal. (C) Una mezcla de Bt 407-Gfp cepa fluorescente y toxina Cry1C se introdujo en G. mellonella larvas de la alimentación forzada. Después de 24 horas, las bacterias han alcanzado la haemocoel y el cadáver del insecto se llena con B. cereus que expresan la proteína verde fluorescente. (D) Análisis de la expresión in vivo Ilsa 25. Las observaciones microscópicas por epifluorescencia se realizaron en B. cereus llevan pHT315-pilsA'gfp. Las bacterias se aislaron de la hemocele de larvas muertas 24 h después de la infección oral. Bacterias verdes indican la expresión de GFP debido a la activación del promotor de Ilsa. Esto muestra la expresión específica de este gen (CLIA) cuando las bacterias han alcanzado la haemocoel.

Película 1. Divulgación de la solución en el intestino del insecto después de la ingesta oral deion. 10 l de solución de colorante azul fue introducido por la alimentación forzada en la boca del barrenador europeo del maíz larva Ostrinia nubilalis. El tinte se llena rápidamente en el lumen intestinal de las larvas de insectos. Haga clic aquí para ver la película .

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Discussion

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El uso de insectos y especialmente la etapa larval, como modelos de infección para los varios patógenos, se está convirtiendo frecuente. Un modelo de elección para algunos aspectos es Drosophila (mosca del modelo) que se utiliza como adultos y 1,2 etapa larval. El insecto lepidóptero G. mellonella también se ha utilizado principalmente para ensayar la virulencia bacteriana por inyección. La ventaja de tolerar temperaturas más altas (por encima de 37 ° C) que en Drosophila (máximo 25 ° C) es importante cuando los patógenos de mamíferos se van a estudiar. También el tamaño de Galleria es más conveniente para el estudio de la cinética de la infección y el daño tisular. Finalmente, nuestro protocolo describe la posibilidad de utilizar Galleria para la infección oral, que es una ventaja para los estudios relacionados con el tracto digestivo. De manera similar, la etapa larval de otro gran oruga, Manduca sexta, se utiliza para estudiar las infecciones por inyección en el hemocelo y más recientemente para la infección oral 26.B. mori y especies de Spodoptera, que son genomas secuenciados 27 también ofrecen alternativas interesantes, y los genes del huésped puede ser cerrada por métodos de ARNi u otras manipulaciones genéticas 28. Aquí se describe de una manera sencilla, cómo criar larvas de Galleria, la forma de infectar y algunos ejemplos de cómo seguir el proceso de infección y mortalidad puntuación con el fin de mostrar el potencial de tales modelos.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Elisabeth Guillemet, Buisson Christophe y Ludovic Bridoux por su excelente asistencia técnica. Estamos en deuda con Sylvie Salamitou y Fedhila Sinda para la configuración inicial del sistema.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

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References

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El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana
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Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).More

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).

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