Summary
Sondbaserad konfokal laser endomicroscopy möjliggör realtid mikroskopi av den mänskliga urinvägarna under cystoskopi, ger dynamisk, intravital avbildning av patologiska tillstånd såsom cancer i urinblåsan med cellulär upplösning. Endomicroscopy kan öka den diagnostiska träffsäkerheten av standard vitt ljus endoskopi och ge intraoperativ bildstyrning för att förbättra kirurgisk resektion.
Abstract
Sondbaserad konfokal laser endomicroscopy (CLE) är en framväxande optisk avbildning teknik som möjliggör realtid in vivo mikroskopi av slemhinneytor under vanlig endoskopi. Med program som i luftvägarna 1 och tarm, har 2-6 CLE också undersökts i urinvägarna för cancer i urinblåsan diagnos. Kan lösas med mikron skala upplösning i realtid, förutom 7-10 Cellular morfologi och vävnad mikroarkitektur dynamisk avbildning av normal och patologisk vaskulatur. 7
Den sondbaserad CLE systemet (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, Frankrike) består av en återanvändbar fiberoptisk avbildningssonden kopplad till en 488 nm laser avsökningsenhet. Avbildningssonden är införd i de arbetande kanaler standard flexibla och stela endoskop. Ett endoskop-baserat CLE systemet (Optiscan, Australien), i vilken den konfokala endomicroscopy functionality är integrerad på endoskopet, används också i mag-tarmkanalen. Med tanke på den större omfattningen diametern dock tillämpning i urinvägarna närvarande begränsat till ex vivo användning. 11 Confocal bildtagning sker genom direkt kontakt mellan avbildningssonden med målvävnaden och redovisas som videosekvenser. Såsom i mag-tarmkanalen, kräver endomicroscopy i urinvägarna ett exogenenous kontrastmedel-vanligast fluorescein, som kan administreras intravenöst eller intravesikalt. Intravesikal administrering är en väletablerad metod för att införa farmakologiska medel lokalt med minimal systemisk toxicitet som är unik för urinvägarna. Fluorescein fläckar snabbt den extracellulära matrisen och har en etablerad säkerhetsprofil. 12 Imaging sonder av olika diametrar möjliggör kompatibilitet med olika kaliber endoskop. Hittills har 1,4 och 2,6 mm sonder utvärderats med flexibel och riGID cystoskopi. 10 senaste tillgång till en <1 mm avbildningssonden 13 öppnar möjligheten CLE i övre urinvägarna under ureteroscopy. Fluorescens cystoskopi (dvs. fotodynamisk diagnostik) och smala band avbildning är ytterligare endoskop-baserade optiska avbildningsmetoder 14 som kan kombineras med CLE att uppnå multimodala avbildning av urinvägarna. I framtiden kan CLE kopplas med molekylära kontrastmedel såsom fluorescensmärkta peptider 15 och antikroppar för endoskopisk avbildning av sjukdomsprocesser med molekylär specificitet.
Protocol
1. Patientförberedelse
- Samtycke patienten planeras för diagnostisk cystoskopi och andra endourological förfaranden, såsom transuretral resektion av urinblåsan tumör (TURBT) för CLE. Inkludera i medgivandet en beskrivning av användningen av intravesikal och / eller intravenös fluorescein som kontrastmedlet. Fråga historia överkänslighetsreaktion mot fluorescein.
- Patienten placeras för cystoskopi (typiskt i lithotomy läge) och framställd på ett sterilt sätt.
- Fortsätt med vanlig vitt ljus cystoskopi (WLC) med en styv eller flexibel cystoskop genom urinröret.
- Undersökning alla regioner i blåsan under vitt ljus (Figur 1) och notera regioner av intresse för CLE undersökning.
- Förutom WLC, kan blåsan skall avbildas med andra makroskopiska optiska avbildningsmetoder inkluderande fluorescens cystoskopi (figur 2A) eller smalt band avbildning (figur 2B) till identify ytterligare områden av misstanke följt av karaktärisering med CLE.
- Använd en diatermi elektrod eller resektion slinga för att placera en liten diatermi märke intill områden av intresse som kommer båda att avbildas och biopsier för patologisk bekräftelse. Den diatermi märket underlättar vidareutnyttjande lokalisering för efterföljande CLE avbildning och biopsi.
2. Kontrastmedel
- Intravesikal instillation av kontrastmedel
- Förbered genom spädning klinisk kvalitet 10% fluorescein-natrium i steril normal saltlösning (0,9% NaCl) till önskad koncentration. Till exempel, förbereda 400 ml 0,1% fluorescein genom utspädning 4 ml av 10% fluorescein i 396 ml normal saltlösning.
- Sätt en steril urinkateter i blåsan och ingjuta utspädd kontrastmedel genom tyngdkraften med en 60 ml kateterspets spruta.
- Kläm fast urinkateter för att hålla inneboende kontrastmedel för 5 minuter.
- Drain kontrastmedel från urinblåsan. Använd 60 ml catheter-tip spruta för att skölja ut kvarvarande kontrast från urinblåsan med normal saltlösning, ca 240-300 ml.
- Fortsätt till CLE avbildning.
- Intravenös injektion av fluorescein
- Dra 1,0 ml fluorescein i sprutan. Fäst sprutan med intravenös åtkomst och injicera 0,5 till 1,0 ml av fluorescein intravenöst som en bolus. Spola linje med normal saltlösning. Detta görs vanligtvis genom anestesi laget i operationssalen.
- Fortsätt till CLE avbildning.
3. CLE Imaging
- Ta bort den steriliserade CLE avbildningssonden (Cellvizio) ur förpackningen och anslut den till laserskanning enhet (Mauna Kea Technologies, Paris, Frankrike)
- Värm upp och kalibrera avbildningssonden genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Sätt tillbaka cystoskopet eller resektoskop i urinblåsan. Använd en 0 graders objektiv med den styva cystoskop.
- Främja CLE avbildningssonden längs working kanal cystoskopet med spetsen precis utanför cystoskop.
- Under vitt ljus, lokalisera tidigare markerade områdena av intresse. Använd ytterligare normal saltlösning bevattning som behövs för visualisering av slemhinnan och upprätthålla måttlig uttänjning av blåsan.
- Manipulera CLE avbildningssonden med operatörens hand för direkt en face kontakt av regionerna av intresse. För optisk sektionering av regionerna av intresse, försiktigt öka och minska trycket till avbildningssonden bibehållen direktkontakt.
- För att nå tumörer belägna vid den främre blåsan, kan en vanlig Albarran bro underlätta avböjning av avbildningssonden för direkt kontakt med regionen av intresse (figur 2C).
- Vanliga områden av intresse papillär tumör, icke-papillär tumör, övergången mellan normal-framträdande slemhinna och tumör och patchar erytematösa, som alla kan avbildas antingen intraveSical eller intravenös fluorescein administration. Intravenös fluorescein krävs för avbildning av resektion sängen, prostatiska uretra och penis urinröret.
- Som avbildningssonden skannar regionen av intresse, spelar in bilder för framtida analys. Observera övergripande cellulär morfologi, gräns, organisation och närvaro av neo-angiogenes.
- Efter avslutad bildbehandling, ta bort CLE avbildningssonden från arbetskanal.
- Om så önskas, få kalla kopp biopsier från motsvarande regioner av intresse som skannades av CLE. Använd diatermi markeringar som landmärken för samarbete registrering av de avbildade områden som biopsier.
- Komplett TURBT per rutin. Hos patienter som fick intravenös fluorescein, överväga att använda kontinuerligt flöde resectoscopes att förbättra visualisering under resektion, som fluorescein utsöndras via njurarna i urinblåsan ca 5 min efter intravenös administrering.
- Hämta sparade bilden inspelningar från konfokal processor och conduct bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CLE bilder sparas som gråskala filer videosekvens vid 12 bilder per sekund. Bildtolkning sker i realtid och kan användas för att påverka den kliniska beslutsfattande under en undersökning protokoll. Offline analys, vilket inkluderar granskning av videosekvensen, ytterligare bildbehandling som mosaicing, 7 och jämförelser med vanlig patologi, är viktiga under inlärningskurvan fasen förknippas med tekniken. Figurerna 1B och 1C är representativa CLE bilder erhållna från två olika tumörer i urinblåsan med intravesikal och intravenös fluorescein resp. För tumörer i urinblåsan, cellulära funktioner (t.ex. morfologi, sammanhållning och gränser) och microarchitectural funktioner (t.ex. platta kontra papillär tumörer, vävnader organisation och vaskulära funktioner) noteras att skilja mellan godartade och elakartade lesioner och låg och hög kvalitet cancer. Med tanke på imaging prober kan bytas mellan olika types av cystoscopes kan CLE kombineras med andra framväxande avbildningsmetoder, inklusive fluorescens cystoskopi (Figur 2A) och smalt band avbildning (Figur 2B), vilket kan förbättra den diagnostiska noggrannheten hos endera tekniken i sig.
Figur 1. Representativa bilder från WLC och CLE beroende intravesikal kontra intravenös administrering av fluorescein. A. WLC med intravesikalt färgade papillär tumör. 2,6-mm avbildningssonden syns längst ned i bilden. B. CLE av intravesikalt färgade papillär tumör. C. CLE av intravenöst färgas papillär tumör. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Adjunktiva makroskopiska avbildningsmetoder och ytterligare verktyg. A. CLE avbildning i kombination med fluorescens cystoskopi (med administration av hexaminolevulinat hydroklorid). CLE avbildningssonden syns på vänster sida av bilden. B. CLE avbildning i kombination med smalt avbildning. CLE avbildningssonden syns på vänster sida av bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att uppnå och upprätthålla fast en face kontakt mellan avbildningssonden och urinblåsan slemhinnan är det mest kritiska steget i att förvärva optimal bildkvalitet. Det är ungefär en 3-5 patienter inlärningskurva att utveckla skicklighet att manipulera avbildningssonden och hålla sonden stadigt under bildinhämtning. Dessutom, eftersom detta förfarande genomföres in vivo, kan patientrörelser (dvs. respiratorisk) och vaskulära pulsationer påverkar kontakten avbildningssonden med blåsan. Den interobserver varians och inlärningskurvan för bildtolkning, vilket kräver erfarenhet brett spektrum av urinblåsan patologi, är för närvarande under utredning. Variation i bildkvaliteten kan tillskrivas vävnad variabilitet och underliggande patologi. Avbildning av de normala områden, förutom de misstänkta visas områdena, är användbar för att utvärdera bildkvaliteten och fluorescein färgning.
Kauterisation marking av varje område av intresse är till hjälp för att underlätta ny lokalisering av avbildas och skärs vävnad, när blåsan töms och fylls flera gånger mellan bildtagning och resektion. Detta steg, som kallas co-registrering, är viktigt för jämförande analys för att korrelera bilder erhållna genom CLE med histologi. Båda förfaranden för intravesikal och intravenös administrering av fluorescein beskrivs ovan, med vissa skillnader i fråga om att timing och krav för intravenös access. 8
Beroende på den anatomiska läge och mikroskopiska egenskaper som skall avbildas, det optimala läget och tidpunkten för administrationen fluorescein måste bestämmas experimentellt. Hos patienter som fick intravesikal fluorescein, kan ytterligare intravenösa fluorescein administration ges till bild de regioner som inte färgas (t.ex. tumör säng, urinröret).
En 2,6 mm avbildningssonden användes i denna markonstration. Emellertid kan principen komma blåsan med sond-baserad teknik utnyttjas i kommande generationer av imaging prober som förbättrar bildkvaliteten i mindre och mer lättmanövrerad sonder. Imaging sonder 1 mm i diameter har nyligen beskrivits. Dessa mindre avbildning sonder kan tillåta CLE avbildning i öppenvården cystoskopi samt in vivo konfokal avbildning av övre urinvägarna under ureteroscopy 13.
Slutligen kan nya kontrastmedel specifika för cancer i urinblåsan utvecklas som förbättrar bildkvaliteten. Tekniken demonstreras av ingjuta kontrastmedel har intravesikalt betydande löfte eftersom patienten har lägre risk för systemisk exponering jämfört med intravenös injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Mauna Kea Technologies för teknisk support. Författarna tackar också Shelly Hsiao för tekniskt bistånd och Kathleen E. Mach för kritisk granskning. Detta arbete stöddes delvis av NIH R01CA160986 till JCL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellvizio 100 Series | Mauna Kea Technologies | 100 Series | Includes confocal processor and LSU: F400-v2 at 488 nm |
| Cellvizio Confocal Miniprobe | Mauna Kea Technologies | Gastroflex UHD | |
| AK-FLUOR 10% | Akorn, Inc. | NDC 17478-253-10 |
References
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur. Respir. J. 33, 974-985 (2009).
- Dunbar, K. B., Okolo, P. 3rd, Montgomery, E., Canto, M. I. Confocal laser endomicroscopy in Barrett's esophagus and endoscopically inapparent Barrett's neoplasia: a prospective, randomized, double-blind, controlled, crossover trial. Gastrointest. Endosc. 70, 645-654 (2009).
- Buchner, A. M., et al. Comparison of probe-based confocal laser endomicroscopy with virtual chromoendoscopy for classification of colon polyps. Gastroenterology. 138, 834-842 (2010).
- Pech, O., et al. Confocal laser endomicroscopy for in vivo diagnosis of early squamous cell carcinoma in the esophagus. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 6, 89-94 (2008).
- Goetz, M., et al. In vivo confocal laser endo microscopy of the human liver: a novel method for assessing liver microarchitecture in real time. Endoscopy. 40, 554-562 (2008).
- Meining, A., et al. Detection of cholangiocarcinoma in vivo using miniprobe-based confocal fluorescence microscopy. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 6, 1057-1060 (2008).
- Wu, K., et al. Dynamic real-time microscopy of the urinary tract using confocal laser endomicroscopy. Urology. 78, 225-231 (2011).
- Sonn, G. A., et al. Optical biopsy of human bladder neoplasia with in vivo confocal laser endomicroscopy. J. Urol. 182, 1299-1305 (2009).
- Sonn, G. A., et al. Fibered confocal microscopy of bladder tumors: an ex vivo study. J. Endourol. 23, 197-201 (2009).
- Adams, W., et al. Comparison of 2.6- and 1.4-mm imaging probes for confocal laser endomicroscopy of the urinary tract. J. Endourol. 25, 917-921 (2011).
- Wiesner, C., et al. Confocal laser endomicroscopy for the diagnosis of urothelial bladder neoplasia: a technology of the future? BJU Int. 107, 399-403 (2011).
- Wallace, M. B., et al. The safety of intravenous fluorescein for confocal laser endomicroscopy in the gastrointestinal tract. Aliment. Pharmacol. Ther. 31, 548-552 (2010).
- Konda, V. J. A., et al. First assessment of needle-based confocal laser endomicroscopy during EUS-FNA procedures of the pancreas (with videos. Gastrointest. Endosc. 74, 1049-1060 (2011).
- Liu, J. -J., Droller, M., Liao, J. C. New Optical Imaging Technologies in Bladder Cancer: Considerations and Perspectives. J. Urol. 188, 361-368 (2012).
- Hsiung, P. -L., et al. Detection of colonic dysplasia in vivo using a targeted heptapeptide and confocal microendoscopy. Nat. Med. 14, 454-458 (2008).
