Een Low Cost Setup voor Behavioral Audiometrie in Knaagdieren

Summary

Een snelle en goedkope methode voor de gedrags-bepaling van het horen van parameters zoals gehoordrempels, gehoorproblemen of fantoom perceptie (subjectieve tinnitus) wordt beschreven. Het gebruikt pre-puls remming van de akoestische schrikreactie en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in een personal computer met een programmeerbare AD / DA-omzetter en een piezo sensor.

Abstract

In auditieve dieronderzoek is het cruciaal om over precieze informatie over basic horen parameters van de proefdieren die betrokken zijn bij de experimenten. Dergelijke parameters kunnen fysiologische respons kenmerken van de auditieve pad, bijv. via hersenstam audiometrie (BERA). Maar deze methoden kan slechts indirect en onzeker extrapolaties over de auditieve waarneming die overeenkomt met deze fysiologische parameters. De perceptuele niveau van gehoor beoordelen gedragsmatige methoden moeten worden gebruikt. Een potentieel probleem met het gebruik van gedrags methoden voor de beschrijving van de waarneming in diermodellen is dat de meeste van deze methoden een soort leerparadigma voor de onderwerpen kunnen worden getest gedragsmatig betrokken, kunnen bijvoorbeeld dieren leren een hefboom indrukken reactie om een ​​geluidsbron. Aangezien deze leren paradigma verandering waarneming zelf ^1,2 zij bijgevolg zal beïnvloeden enig resultaat over waarneming verkregen metdeze methoden en moeten daarom met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Uitzonderingen zijn paradigma's die gebruik maken van reflexen te maken, omdat hier geen leren paradigma's moeten worden uitgevoerd voorafgaand aan perceptuele testen. Een van deze reflex is de akoestische schrikreactie (ASR), die kan zeer reproduceerbaar worden opgewekt met onverwachte harde geluiden bij naïeve dieren. Dit ASR kan weer worden beïnvloed door voorafgaande geluid afhankelijk van de waarneembaarheid van deze eerdere stimulus: Geluiden ruim boven gehoordrempel volledig de amplitude van de ASR remmen, klinkt dichtbij drempel nauwelijks remmen de ASR. Dit fenomeen wordt pre-puls inhibitie (PPI) ^3,4, en de hoeveelheid PPI de ASR geleidelijk afhankelijk van de waarneembaarheid van de pre-puls. PPI van de ASR is daarom zeer geschikt voor gedragsproblemen audiogrammen bepalen naïef, niet-getrainde dieren, auditieve beperkingen vast te stellen of zelfs om mogelijke subjectieve tinnitus percepten op te sporen in dezedieren. In dit artikel tonen we het gebruik van deze methode in een knaagdier model (zie ook ref. ^5), de Mongoolse gerbil (Meriones unguiculatus), dat is een goed modelsoort weet schrikreactie onderzoek binnen de normale menselijke gehoor bereik (bijv. ^6).

Protocol

1. Setup Montage en Software Programmeren

1. Installeer een D / A-kaart in een Personal Computer (bijv.: NI PCI 6229, National Instruments) en het naar een breakout-box (bijv.: BNC-2110, National Instruments) aan te sluiten, moeten beide ondersteunen ten minste een ingang en een uitgang kanaal met een bemonsteringsfrequentie van 44,1 kHz ten minste elk.
2. Verbind de uitgang van de breakout-box via BNC-kabel aan op een goede versterker (bijvoorbeeld: AMP75 breedband versterker, Thomas Wulf).
3. Installeer een infrarood webcam (bijvoorbeeld: Grand IP Camera Pro, Grandtec Electronics) voor dierlijke bewaking in het donker.
4. Installeer een Integrated Development Environment (bijv.: Matlab) om een programma in de zin van het stroomschema in Figuur 1 te implementeren. Een versie die op Matlab 2007b kunnen worden verkregen kosteloos uit de desbetreffende auteur.
5. Binnen een geluiddichte kamer installeren van een luidspreker op een tafel. Sluit de luidspreker to de geluidsversterker.
6. Installeer een piëzo-sensor (bijv. krachtsensor FSG15N1A, Honeywell) op de top van een isolerende plaat, ondersteunen met kracht en sluit deze via BNC-kabel aan op de ingang van de breakout-box; begane grond van het sensorsignaal.
7. Bouw een meetkamer van een acryl glazen buis aan de grootte van het knaagdier te meten (bijv. voor gerbils: lengte 15 cm, inwendige diameter 4,3 cm, 4,8 cm diameter). Bevestig een rooster met een maaswijdte van 0,5 mm aan de voorzijde van de buis en een gewatteerde deur met een vergrendelingsmechanisme (bijvoorbeeld een haak) naar achteren. De fixatie kan met hete lijm, de deur alleen het scharnier en de borg voor de haak is bevestigd aan de buis.
8. Bevestig schuimplastic voeten die de meetbuis afmetingen passen op de isolerende sensor bord. Voeten dient de buis onder de voor-en achterkant en til de buis om de sensor niveau. Zorg ervoor dat er licht contact tussen de piëzo-sensor en de meetkamer. Bevestig de sensor bord met de meetkamer in het midden van de voorkant van de luidspreker en zet een microfoon voor geluidsregeling ernaast (bijv. B & K Type 2669 / B & K Type 4190 aangesloten op meetversterker B & K Type 2610, alle: Bruel en Kjaer) op het niveau van de dieren hoofd zodat het niet stoort met de buis.
9. Merk op dat de kwaliteit van uw audiometrische gegevens zal afhangen van de kwaliteit van uw geluidsinstallatie. In elk geval de microfoon en meetversterker de frequentie overdrachtsfunctie van het systeem voor bepalen de eerste experimenten en een routine in software te corrigeren voor deze frequentie overdrachtsfunctie de spectrale uitgang van platte luidspreker te omvatten.
10. Lijn de webcam met de setup, zodat men kan het gedrag van dieren te controleren.

2. Behavioral Bepaling van gehoordrempels (audiogrammen)

1. Neem het dier uit zijn kooi en zet het hoofd eerst in de buis, cverliest de deur.
2. Plaats de buis op het schuim voeten en de sensor. Schakel geen licht en sluit de deur naar de kamer. De kamer zelf is niet voorzien van airconditioning, maar heeft de temperatuur, vochtigheid en andere milieu-variabelen van de omliggende laboratorium. Luchtverversing door ventilatoren wordt afgeraden vanwege de geïnduceerde ruis, maar het volume van de kamer ondersteunt zuurstof voor het dier voor vele uren. Wacht 15 minuten zodat het dier om te wennen aan de setup. De acclimatisatie is gunstig voor het dier als het kan kalmeren in zijn eigen tempo en te wennen aan de buis. Anderzijds, een geen verschillen in gedrag te zien tijdens de acclimatisatie gedurende een aantal sessie, dat aangeeft dat een extra sessie voor het dier vertrouwd met de buis en de kamer voor het experiment niet nodig.
3. Start het programma en definieer de parameters voor stimulatie (zie ook ref ^5.): Stimuli bestaan ​​uit zuivere tonen met verschillende frequentiesquenties. De schrik stimulans moet worden gepresenteerd met een geluidsdruk hoog genoeg is om reproduceerbaar wekken een schrikreactie. In ons lab gebruiken we de intensiteit van 105 dB SPL (stimulus duur 6 ms, waaronder 2 ms cosinus-squared opkomst en ondergang hellingen) om schrikreacties te lokken in het Mongools gerbils. De test stimuli vóór de schrikreactie stimuli worden aangeboden op verschillende frequenties en intensiteiten in het bereik te testen, gewoonlijk beneden gehoordrempel zelfs ruim boven de drempel en frequenties die het gehele hoorbare bereik van de soort. Frequentie en duur van de schrik en de test stimulans zijn op elkaar afgestemd in elke proef wordt de interstimulus interval tussen schrikreacties en test stimulus ingesteld op 100 ms. Gebruik ten minste 15 herhalingen met gerandomiseerd interstimulus intervallen van 10 ± 2,5 sec voor elke frequentie en intensiteit combinatie van de test stimuli (zie figuur 2A, links). Volgende test stimuli kan hetzij in gerandomiseerde of niet-rendedomized orde. Als u gebruik maakt van een niet-gerandomiseerde aanpak (bijvoorbeeld een test stimulus niveau vastgesteld voor alle geteste frequenties) heeft 5 min van herstel tussen de verschillende stimulus sets. Merk op dat de absolute drempel bepaald afhankelijk van de randomisatie van de stimuli, maar mogelijke relatieve verschuivingen drempel niet (bijvoorbeeld na akoestisch trauma, zie. Ref. ^5).
4. Voorafgaand aan de analyse van de gegevens, verwijder ongeldige trials uit dataset (bijvoorbeeld studies waar het dier verplaatst voordat de schrik stimulus;. Zie Figuur 2B).
5. Binnen een tijdvenster van de eerste 50 ms na de schrikreactie stimulus, berekent de respons amplitude (piek tussen de eerste maximum piek tot de eerste minimum van de respons) en response latency (tijd vanaf start van de reactie stimulus onset) van iedere afzonderlijke studie .
6. Plaats een Boltzmann-functie om de volledige respons amplitude dataset van een frequentie gesorteerd voor prestimulus intensiteit voor alle geldige single proeven. Het 50% punt van de Boltzmann-functie ⁷ geeft de gehoordrempel voor deze stimulatie frequentie.

3. Akoestische Trauma en kwantificatie van slechthorendheid

1. Bereid ketamine-xylazine-anesthesie met een mengsel van ketamine hydrochloride: 96 mg / kg (ketamine-ratiopharm, Ratiopharm); xylazinehydrochloride: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer); atropinesulfaat: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) en fysiologische NaCl-oplossing (Berlin-Chemie AG, Berlijn) met een verhouding van 9:1:2:8.
2. Injecteer het dier met 3 ml / kg subcutaan anesthesie. Wacht tot het dier is diep verdoofd (ca. 5 min, check reflexen, bijvoorbeeld, gebruikt u de pedaal terugtrekking reflex). Om anesthesie te handhaven tijdens metingen continu injecteren het anestheticum met een snelheid van 3 ml / kg / uur met een injectiepomp. Controle vitale functies met de juiste apparatuur (bijv., ademen via camera) en houd het dier warm door placing het op een opwarming pad.
3. Braken een akoestisch trauma, bijvoorbeeld met een luide zuivere toon: bv 2 kHz bij 115 dB SPL voor 75 minuten.
4. Na het einde van trauma stop de spuit pomp en wakker laten het dier in een wake-up kooi op een warming pad op een rustige plek. Controleer regelmatig tijdens het ontwaken fase als de vitale functies zijn stabiel. Zet het dier in zijn kooi alleen als het helemaal wakker. Laat het dier te herstellen van de narcose (minimaal 2 dagen) en de rest in haar kooi.
5. Opnieuw uit te voeren 2,1 tot 2,6. Vergelijk de gehoordrempels voor en na de akoestische trauma door het percentage van gehoorverlies voor elke frequentie. Na het einde van alle experimenten pijnloos laten inslapen van het dier.

4. Test voor akoestische Phantom Perception (subjectieve tinnitus)

1. Voer deze metingen voor en na akoestisch trauma.
2. Volg 2,1 tot 2,2 als het dier nog niet in de setup.
3. A nANTAL stimulatie paradigma kan worden gebruikt om knaagdieren subjectieve tinnitus testen. De verhouding in al deze benaderingen is te testen op de saillantie van een stille kloof in de ruis. Indien de afstand waargenomen door de dieren kan worden gebruikt als een test stimulus een schrikreactie analoog aan de procedure beschreven in 2 verminderen. Als het dier lijdt aan tinnitus (dat is waarschijnlijk te ontwikkelen na de akoestische trauma), zal dit tinnitus worden waargenomen binnen de stille kloof en maakt daardoor de kloof minder saillant. Het effect van de opening aan de schrikreactie dus zal zwakker zijn in tinnitus dieren in vergelijking met gezonde controles (gereduceerd PPI, cfr. ^8). Deze waarneming is getest met twee licht verschillende protocollen.
4. In de eerste subjectieve tinnitus paradigma hier gepresenteerde (. Figuur 2A, midden, zie ⁹⁾ gebruik maken van de volgende parameters voor stimulatie: schrikreacties geluidsintensiteit 105 dB SPL met frequenties van 1 tot 16 kHz in 1 octaaf stappen, Stimulons lengte 6 ms, waaronder 2 ms cosinus-squared opkomst en ondergang hellingen. Indiening van een witte ruis achtergrond van 50 dB SPL tijdens het experiment, met of zonder 15 ms gat dat de schrikreactie stimulus vooraf met 100 ms; aanwezig minste 15 proeven voor elke frequentie en gap-toestand. Bij gebruik van een niet-gerandomiseerde aanpak, zodat 5 min herstel tussen de verschillende stimulus sets. Het gebruik van verschillende schrikreacties stimulus frequenties geeft een ruwe schatting van de waargenomen tinnitus frequentie.
5. Als tweede subjectieve tinnitus paradigma (Figuur 2A, rechts) kunt u gebruik maken van de volgende stimulatieparameters: schrikreacties geluidsintensiteit 105 dB SPL, dubbelklikt u op stimulus met 0,1 ms duur per klik en 0,1 ms tussen de klikken, de tweede klik met de omgekeerde richting opzichte van het eerste. Indiening van een bandpass gefilterde ruis achtergrond van 50 dB SPL met een Gaussiaanse filter breedte van 0,5 octaven centrale frequenties van 1 tot 16 kHz in octaaf. Presenteer deze ruis either met of zonder 15 ms gat dat de schrikreactie stimulus van 100 ms voorafgaat; aanwezig minste 15 proeven voor elke frequentie en gap-toestand. Bij gebruik van een niet-gerandomiseerde aanpak, zodat 5 min herstel tussen de verschillende stimulus sets. Het gebruik van verschillende centrale frequenties van de bandpass achtergrondgeluid geeft een ruwe schatting van de waargenomen tinnitus frequentie.
6. Volg 2,4 tot 2,5; normaliseren alle verkregen data met referentiegegevens voor elke geteste frequenties en elk trauma toestand, dwz voor en na een akoestisch trauma.. Deze referentie is het antwoord amplitude van de zuivere toon schrik stimulus zonder prestimulus (zie 2.3). De frequentie wordt ofwel bepaald door de zuivere toon of de centrale frequentie van de bandpass gefilterde ruis. Bereken de gemiddelde respons van elke referentie en normaliseren elke berekend responsamplitude door deze te delen door zijn referentie.
7. Bereken PPI door het genormaliseerde reactie amplitudes van de spleet condition door het gemiddelde van de genormaliseerde no gap-toestand van elke geteste frequenties.
8. Bereken de PPI verandering na het trauma in procenten voor elke geteste frequentie.

De schrikreacties dieren zijn eenvoudig te genereren en te analyseren. Figuur 2B geeft een overzicht van een typisch gevolg van een dier gestimuleerd met een pure toon van 105 dB SPL zonder prestimulus voor 15 keer. De meerderheid van de studies zijn geldige en ongeldige proeven zijn gemakkelijk te herkennen (proeven gemarkeerd door rode vierkant). De reactie amplitudes en latenties worden berekend alleen geldig proeven.

Een typische gedrag drempel verandering is weergegeven in figuur 3A. De audiogram van een voorbeeld dier verkregen met de werkwijze beschreven in 2 wordt gegeven (blauw) en na (rood) een akoestisch trauma bij 2 kHz (geel gebied). Een duidelijke gehoorverlies specifiek getoond bij 2 kHz. De antwoorden met betrekking tot een subjectieve tinnitus waarneming kan wordengezien in figuur 3B worden de genormaliseerde reactie amplitudes van hetzelfde dier als hierboven getoond voor exemplarisch stimulaties een octaaf onder en boven het trauma zoals beschreven in 4.5. De vergelijking van de reacties op stimuli met en zonder gat voor (blauw) en na het trauma (rood) kan een interpretatie van een mogelijke tinnitus waarneming. Onder de frequentie trauma geen verandering van responspatroon vindt terwijl boven het trauma het effect van de spleet verdwenen na trauma, hetgeen een mispercept op deze frequentie.

Figuur 1. Stroomdiagram van het programma dat de gedrags drempels en persoonlijke data tinnitus verkrijgen. Dit is slechts een vereenvoudigde versie van de programmacode. Afkortingen: GUI - grafische gebruikersinterface; ISI - inter stimulus interval.

Figuur 2. Schrikreacties op geluiden (ASR) stimuli. Een schema van de drie verschillende stimuleringsprotocollen toegepast. Linkerpaneel: pre-puls inhibitie (PPI) van de ASR gemeten zonder zuivere toon-test stimulus voor (groen) de schrik toon (rood), de respons periode is weergegeven in blauw. Middenpaneel: gap / noise paradigma met zuivere toon schrikreacties stimulus presentatie van verschillende frequenties op een witte ruis achtergrond. Rechts panel: gap / noise paradigma met klik schrikreacties stimulus presentatie over bandpass gefilterde achtergrond van verschillende middenfrequenties B Voorbeeldige auditieve schrikreacties van 15 studies opgenomen met de drempel paradigma zonder prestimulus bij 1 kHz stimulatie frequentie.. Drie studies worden geteld ongeldig (rode vierkantjes) als het dier bewoog al voordat de stimulatie begin.

<img alt = "Figuur 3" src = "/ files/ftp_upload/4433/4433fig3.jpg" />
Figuur 3. Illustratieve resultaten van ASR in een dier. Een Behavioral drempel voor (blauw) en na (rood) van de akoestische trauma bij 2 kHz (geel gebied). De drempels worden berekend op basis van de antwoorden op de PPI gemoduleerde ASR-protocol met behulp van de Boltzmann-functie keerpunt als drempelwaarde. Merk op dat het gehoorverlies bij 2 kHz bedraagt ​​meer dan 66%, terwijl farer weg van het trauma frequentie men vaak kan zelfs verbetering van gehoordrempels zie B Genormaliseerde reactie amplitudes (open cirkels:. Enkele proeven, gevulde cirkels: betekent, bakkebaarden: standaardafwijking) tijdens de stimulatie met de opening / ruis klik ASR protocol (4.5) voor 1 en 4 kHz middenfrequenties. Reacties worden gesorteerd voor proeven met en zonder gat in het geluid voor en na trauma bij 2 kHz. Pas bij 4 kHz het effect van de spleet verdwijnt na trauma die een persoonlijke tinnitus waarneming geeft in ditfrequentie.

Discussion

We presenteren een goedkope en gemakkelijk te bouwen installatie voor audiometrische metingen in knaagdieren op basis van vooraf pols remming van akoestische schrikreacties die kunnen worden gebruikt om gedrags gehoor drempels (= audiogrammen ¹⁰⁾ en auditieve waarneming fantoom als subjectieve tinnitus ¹¹ te bepalen. Vooral de laatste metingen zijn in het brandpunt van een aantal recente rapporten ^8,12,13,14 en kan worden gezien als een noodzakelijke voorwaarde voor elektrofysiologische onderzoeken van neuronale mechanismen deze ziekte. Met deze methode is het mogelijk onderscheid te maken welke dieren heeft een subjectieve tinnitus percept na de akoestische trauma en die dat niet deden ontwikkelen, en dan verder deze mensen, bijvoorbeeld, te onderzoeken met elektrofysiologische opnamen in primaire auditieve cortex.

Een kritische stap in de analyse van de schrikreactie gegevens na akoestisch trauma is het normaliseren van de gegevens van de schrikreactie amplitude die kanmaximaal worden opgewekt zonder voorafgaande testen stimulus: Dit is vooral belangrijk om minder schrikreacties op basis van gehoorverlies van verminderde PPI in tinnitus dieren te onderscheiden: De gevolgen van de akoestische trauma in de tijd variëren, omdat het dier gedeeltelijk herstelt van, maar ongeveer 50 % van het gehoorverlies is permanent. In tegenstelling tot rapporten bovengenoemde waarbij de gehoordrempels getest maar niet voor ijking we geprobeerd de effecten van de verschillende gehoordrempels van elke frequentie en het effect van de akoestische trauma zelf te minimaliseren door het normaliseren van elk responsamplitude met een referentie. Daarnaast gebruiken we twee verschillende soorten protocollen aan een tinnitus waarneming te beoordelen, met de eerste (4.4) beter werken voor dieren getest over langere tijdschalen van een week na het trauma op en de tweede "klassieke" (4,5) beter werken voor dieren getest in een week na het trauma.

Een beperking van deze methode is clearly dat men niet kan beoordelen de acute effecten van een akoestische trauma. Minstens twee dagen tussen de anesthesie en de eerste na-metingen worden gekozen omdat het dier te herstellen. Een schatting van acute gehoorverlies verkrijgen direct na trauma, hersenstam audiometrie (BERA) worden gebruikt.