En låg kostnad Setup för Behavioral Audiometri hos gnagare

Summary

En snabb och billig metod för beteendemässiga bestämning av hörsel parametrar som hörtrösklar, hörselnedsättningar eller Phantom uppfattningar (subjektiv tinnitus) beskrivs. Den använder förpuls inhibering av den akustiska skrämsel och kan lätt implementeras i en persondator som använder en programmerbar AD / DA-omvandlare och en piezo-sensor.

Abstract

I auditiv djurförsök är det viktigt att ha exakt information om grundläggande hörsel parametrar för de djurförsök som är involverade i försöken. Sådana parametrar kan vara fysiologiska respons hos den auditiva vägen, t.ex. via hjärnstammen audiometri (BERA). Men dessa metoder tillåter bara indirekta och osäkra extrapoleringar om hörsel percept som motsvarar dessa fysiologiska parametrar. För att bedöma den perceptuella nivån hörsel, beteendemässiga metoder måste användas. Ett potentiellt problem med användningen av beteende metoder för beskrivning av uppfattningen i djurmodeller är det faktum att de flesta av dessa metoder innebär någon form av lärande innan de ämnen kan beteendemässigt testas, kan t.ex. djur måste lära sig att trycka på en spak i svar på ett ljud. Eftersom dessa lärande paradigm förändras uppfattning själv ^1,2 de därmed kommer att påverka något resultat om perception som erhållits meddessa metoder och därför måste tolkas med försiktighet. Undantag är paradigm som utnyttjar reflex svar, eftersom här inte lärande paradigm måste genomföras innan perceptuella testning. En sådan reflex är ett akustiskt skrämsel (ASR) som kan mycket reproducerbart kan framkallas med oväntade höga ljud i naiva djur. Denna ASR i sin tur kan påverkas av föregående ljud beroende på förnimbarheten av denna föregående stimulans: Låter väl över hörtröskel fullständigt inhiberar amplituden hos ASR, låter nära tröskeln kommer endast något inhibera ASR. Detta fenomen kallas förpuls inhibering (PPI) ^3,4, och mängden av PPI på ASR gradvis beror på förnimbarheten av förpulsen. PPI för ASR är därför väl lämpad att bestämma beteende audiogram i naiva, icke-utbildade djur, för att bestämma hörselnedsättningar eller ens att upptäcka eventuella subjektiva tinnitus percepts i dessadjur. I detta dokument visar vi användningen av denna metod i ett gnagarmodell (jfr även ref. ^5), den mongoliska gerbil (Meriones unguiculatus), vilket är en väl vet modell arter skrämsel forskning inom det normala mänskliga örat räckvidden (t.ex. ^6).

Protocol

1. Inställning Montering och programmering

1. Installera en D / A-kort i en dator (t.ex. NI PCI 6229, National Instruments) och anslut den till en utbrytning-box (t.ex. BNC-2110, National Instruments), bör båda stödja minst en ingång och en utgång kanal med en samplingsfrekvens på åtminstone 44,1 kHz vardera.
2. Anslut utgången på Breakout-boxen via BNC-kabel till en sund förstärkare (t.ex. AMP75 bredband effektförstärkare, Thomas Wulf).
3. Installera en infraröd webbkamera (t.ex. Grand IP Camera Pro Grandtec Electronics) för djur övervakning i mörker.
4. Installera en integrerad utvecklingsmiljö (t.ex. Matlab) för att genomföra ett program som definieras av flödesschemat i figur 1. En version som körs på Matlab 2007b kan erhållas kostnadsfritt från motsvarande författare.
5. Inom ett ljudisolerat kammare installera en högtalare på ett bord. Anslut högtalaren to ljudet förstärkaren.
6. Montera en piezo-sensor (t.ex. kraftsensor FSG15N1A, Honeywell) ovanpå en isolerande kartong, stödja det med kraft och anslut den via BNC-kabel till ingången breakout-box, mark sensorsignalen.
7. Bygg en mätkammare från en akryl glasrör anpassas till storleken på gnagare att mäta (för gerbiler t.ex. längd 15 cm, inre diameter 4,3 cm, yttre diameter 4,8 cm). Fäst en galler med en maskvidd av 0,5 mm till framsidan av röret och en vadderad dörr med en låsmekanism (t.ex. en krok) bakåt. Fixeringen kan göras med varmt lim, för dörren endast gångjärnet och bygeln för kroken är fäst vid röret.
8. Bifoga fötterna skumplast som passar mätröret dimensioner på det isolerande sensorns styrelsen. Fötter bör stödja röret under den främre och bakre änden och lyft röret till sensorn nivån. Se till att det finns ljus kontakt mellan piezo sensor och mätkammaren. Fäst sensorn styrelsen med mätkammaren centrerad framför högtalaren och sätta en mikrofon för ljudkontroll bredvid (t.ex. B & K typ 2669 / B & K Typ 4190 är ansluten till mätförstärkare B & K Typ 2610, alla: Bruel och Kjaer) i nivå av djur huvudet så att det inte stör röret.
9. Observera att kvaliteten på dina audiogram kommer att bero på kvaliteten på ditt ljudsystem. I varje fall använda mikrofonen och mätning förstärkare för att bestämma funktionen frekvensen överföringen av ditt system innan dina första experiment och inkluderar en rutin i din programvara för att korrigera för denna frekvens överföringsfunktion för att göra den spektrala produktionen av dina högtalare platt.
10. Rikta in webbkameran med installationen så att man kan övervaka djurens beteende.

2. Behavioral Fastställande av hörtrösklar (audiogram)

1. Ta djuret från dess hem bur och lägga den huvudet först i röret, cförlorar luckan.
2. Sätt röret på skummet fötter och sensorn. Stäng av allt ljus och stänga dörren till kammaren. Kammaren själv är inte luftkonditionerade men har temperatur, luftfuktighet och andra miljövariabler i den omgivande laboratoriet. Luft förändring genom ventilatorer är inte tillrådligt på grund av den inducerade brus men volymen av kammaren stöder syre för djuret för många timmar. Vänta 15 minuter så att djuret vänja sig vid installationen. Den acklimatisering är bra för djuret eftersom det kan lugna ner i sin egen takt och vänja sig vid röret. Å andra sidan, gör man inte se några skillnader i beteende under acklimatisering tiden över flera sessionen, vilket indikerar att en extra session för bekanta djuret med röret och kammaren före experimentet inte behövs.
3. Starta programmet och definiera parametrarna för stimulering (jfr även ref ^5).: Stimuli består av rena toner med olika frekvenskvenser. Den skrämma stimuli måste presenteras med en ljudtrycksnivå tillräckligt högt för att reproducerbart framkalla en skrämma svar. I vårt labb använder vi intensitet 105 dB SPL (stimulans varaktighet 6 ms med 2 ms cosinus-squared uppgång och ramper hösten) för att framkalla skrämmer svar i mongoliska gerbiler. Testet stimuli föregår skrämmer stimuli presenteras vid olika frekvenser och intensiteter i området som ska testas, vanligen underifrån hörtröskel till nivåer väl över tröskeln och med frekvenser som täcker hela hörbara området av arten. Frekvens och varaktighet startle och test stimulans matchas i varje försök, är interstimulus intervallet mellan startle och testa stimulans satt till 100 ms. Använd minst 15 repetitioner med randomiserade interstimulus intervall av 10 ± 2,5 sek för varje frekvens och intensitet kombination av test stimuli (jfr. figur 2A, vänster). Efterföljande tester stimuli kan presenteras antingen i randomiserade eller icke-sprangdomized ordning. Om du använder en icke-randomiserad tillvägagångssätt (t.ex. ett test stimulans nivå som fastställts för alla testade frekvenser) kan 5 minuter av återhämtning mellan olika stimulansåtgärder uppsättningar. Observera att den bestämda absoluta tröskeln kommer att bero på randomisering av stimuli, men möjligt relativa förskjutningar av tröskel kommer inte (t.ex. efter akustisk trauma, jfr. Ref. ^5).
4. Innan analysera data, ta bort ogiltiga försök från dataset (t.ex. rättegångar där djuret flyttas innan skrämma stimulans,. Se Figur 2B).
5. Inom ett tidsfönster på de första 50 ms efter den oväntade yttre stimulans, beräkna svaret amplitud (topp till topp mellan den första maximala till den första minimum svaret) och respons latens (tiden från stimulans start till respons början) av varje enskild prövning .
6. Montera en Boltzmann-funktion till fullständiga uppgifter responsamplitud uppsättning av en frekvens sorteras för prestimulus intensitet för alla giltiga single försök. Den 50% punkt Boltzmann-funktionen ⁷ indikerar hörtröskel för stimulering frekvens.

3. Akustisk trauma och kvantifiering av hörselnedsättning

1. Förbered ketamin-xylazin-anestesi med en blandning av ketamin hydroklorid: 96 mg / kg (Ketamin-ratiopharm Ratiopharm), xylazinhydroklorid: 4 mg / kg (Rompun 2%, Bayer), atropinsulfat: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) och fysiologisk NaCl-lösning (Berlin-Chemie AG, Berlin) med ett förhållande av 9:1:2:8.
2. Injicera djuret med 3 ml / kg av anestesi subkutana. Vänta tills djuret är djupt sövda (ca 5 minuter, kontrollera reflexer, t.ex. använder reflex pedalen tillbakadragande). För att bibehålla anestesi under mätningar, kontinuerligt injicera bedövningsmedel lösningen med en hastighet av 3 ml / kg / timme med användning av en sprutpump. Styr vitala med lämplig utrustning (t.ex. andas genom kamera) och hålla djuret varmt av placing den på en värmande kudde.
3. Inducera en akustisk trauma, t.ex. med ett högt ren ton: t.ex. 2 kHz vid 115dB SPL för 75 minuter.
4. Efter utgången av trauma stoppa sprutpumpen och låt djuret vaken i en väckarklocka bur på en värmande kudde på en lugn plats. Kontrollera regelbundet under uppvaknande fasen om vitala är stabila. Sätt djuret i sitt hem bur endast när den är helt vaken. Låt djuret återhämta sig från anestesi (minst 2 dagar) och vila i sitt hem bur.
5. Utför 2,1 till 2,6 igen. Jämför hörtrösklar före och efter den akustiska traumat genom att beräkna andelen hörselnedsättning för varje frekvens. Efter slutet av alla experiment smärtfritt euthanize djuret.

4. Test för Acoustic Phantom Perception (subjektiv tinnitus)

1. Utför dessa mätningar före och efter den akustiska traumat.
2. Följ 2,1 till 2,2 om djuret inte redan finns i installationen.
3. A numbra av stimulering paradigm kan användas för att testa gnagare för subjektiv tinnitus. Förhållandet i alla dessa metoder är att testa för framträdande av en tyst lucka i ett bakgrundsbrus. Om gapet uppfattas av djuren, kan den användas som ett test stimulans att reducera en skrämsel analogt med det förfarande som beskrivs i 2. Om djuret lider av tinnitus (som sannolikt kommer att utvecklas efter akustisk trauma), kommer denna tinnitus uppfattas inom den tysta gapet och därmed gör gapet mindre framträdande. Effekten av öppningen på skrämsel därför blir svagare i tinnitus djur jämfört med friska kontroller (reducerad PPI, jfr. ^8). Denna percept testas med två lite olika protokoll.
4. I den första subjektiv tinnitus paradigm presenteras här (. Figur 2A, centrum, jfr ⁹⁾ använder följande parametrar för stimulering: skrämma ljudintensitet 105 dB SPL med frekvenser från 1 till 16 kHz i 1 oktav, Stimuloss längd 6 ms med 2 ms cosinus-squared uppgång och ramper faller. Presentera ett vitt brus bakgrund av 50 dB SPL under experimentet, antingen med eller utan en 15 ms mellanrum som föregår skrämma stimulans av 100 ms, närvarande minst 15 försök för varje frekvens och gap-tillstånd. Vid användning av en icke-randomiserad tillvägagångssätt tillåter 5 min återhämtning mellan de olika uppsättningarna stimulans. Användning av olika skrämmer stimulansåtgärder frekvenser kommer att ge en grov uppskattning av den upplevda tinnitus frekvensen.
5. Som en andra subjektiv tinnitus paradigm (Figur 2A, höger) kan du använda följande stimulering parametrar: skrämma ljudintensitet 105 dB SPL, dubbelklicka på stimulans med 0,1 ms varaktighet per klick och 0,1 ms mellan klick, det andra klicket med inverterade riktningen jämfört med det första. Presentera en bandpassfiltreras buller bakgrund av 50 dB SPL med en gaussisk filter bredd på 0,5 oktaver och frekvenser center från 1 till 16 kHz i oktavsteg. Presentera detta buller either med eller utan en 15 ms mellanrum som föregår skrämma stimulans av 100 ms, närvarande minst 15 försök för varje frekvens och gap-tillstånd. Vid användning av en icke-randomiserad tillvägagångssätt tillåter 5 min återhämtning mellan de olika uppsättningarna stimulans. Användning av olika mittfrekvenser av bandpass bakgrundsljud ger en grov uppskattning av den upplevda tinnitus frekvensen.
6. Följ 2,4 till 2,5, normalisera samtliga förvärvade data med en referens dataset för varje testad frekvens och varje trauma skick, dvs före och efter en akustisk trauma.. Denna hänvisning är svaret amplitud på rena toner skrämma stimulans utan prestimulus (jfr 2,3). Frekvensen bestäms antingen av rena toner eller mittfrekvensen av den filtrerade bandpass buller. Beräkna det genomsnittliga utslaget för varje referens och normalisera varje beräknade responsamplitud genom att dividera den genom sin referens.
7. Beräkna PPI genom att dividera de normaliserade respons amplituderna hos gapet condition genom medelvärdet av den normaliserade icke-gap tillstånd hos varje testad frekvens.
8. Beräkna PPI förändringen efter traumat i procent för varje testad frekvens.

De skrämmer svar av djur är lätta att generera och analysera. Figur 2B ger en översikt över en typisk följd av ett djur stimuleras med en ren ton av 105 dB SPL utan prestimulus för 15 gånger. Majoriteten av studierna är giltiga och ogiltiga försök är lätta att känna igen (försök markerad med röd fyrkant). De svar amplituder och latenser beräknas endast på giltiga prövningar.

En typisk beteende tröskel förändring ges i figur 3A. Audiogrammet av en exemplifierande djur som förvärvats med den metod som beskrivs i 2 ges före (blå) och efter (röd) ett akustiskt trauma vid 2 kHz (gul område). En klar hörselnedsättning visas specifikt vid 2 kHz. Svaren rörande en subjektiv tinnitus percept kanses i figur 3B är de normaliserade respons amplituderna hos samma djur som ovan visas exemplariskt för stimuleringar en oktav under och över traumat som beskrivs i 4,5. En jämförelse av svaren på stimuli med och utan lucka innan (blå) och efter trauma (röd) kan en tolkning av en möjlig tinnitus percept. Nedanför trauma frekvensen ingen förändring av svarsmönster kan hittas medan över traumat effekten av gapet försvann efter traumat, vilket indikerar en mispercept vid denna frekvens.

Figur 1. Flödesschema för det program som används för att förvärva de beteendemässiga trösklar och subjektiv tinnitus data. Observera att detta är endast en förenklad version av programkoden. Förkortningar: GUI - grafiskt användargränssnitt, ISI - bland stimulans intervall.

Figur 2. Auditiva skrämsel (ASR) stimuli. En systemen i de tre olika stimuleringsprotokoll används. Vänster panel: förpuls hämning (PPI) för ASR mätt utan rena toner testa stimulans innan (grön) den skrämma tonen (röd), svaret perioden visas i blått. Mittpanelen: gap / brus paradigmet med rena toner skrämma stimulans presentation av olika frekvenser på ett vitt brus bakgrund. Höger panel: gap / brus paradigmet med klick skrämma stimulans presentation på bandpassfiltreras bakgrund av olika mittfrekvenser B Exempel auditiva skrämmer svar 15 försök som spelats in med tröskeln paradigm utan prestimulus vid 1 kHz stimulering frekvens.. Tre försök räknas ogiltiga (röda fyrkanter) som djuret rörde redan innan stimuleringen debut.

<img alt = "Bild 3" src = "/ files/ftp_upload/4433/4433fig3.jpg" />
Figur 3. Exempel resultat ASR i ett djur. En Behavioral tröskel innan (blå) och efter (röd) den akustiska trauma vid 2 kHz (gul område). Tröskelvärdena beräknas från svaren på PPI modulerade ASR protokoll med Boltzmann-funktionen vändpunkt som tröskelvärde. Observera att hörselnedsättning vid 2 kHz uppgår till mer än 66%, medan farer från trauma frekvens man ofta kan se även förbättring av hörtrösklar B Normaliserade svar amplituder (öppna cirklar:. Enda försök, fyllda cirklar: medel, morrhår: standardavvikelse) under stimulering med gapet / brus Klicka ASR-protokoll (4,5) för 1 och 4 kHz-frekvenserna centrum. Svaren sorteras för försök utan och med gapet i bullret före och efter traumat vid 2 kHz. Endast vid 4 kHz effekten av gapet försvinner efter traumat som indikerar en subjektiv tinnitus percept runt dettafrekvens.

Discussion

Vi presenterar ett billigt och lätt att bygga setup för audiometriska mätningar i gnagare bygger på pre-puls hämning av akustiska skrämmer svar som kan användas för att bestämma beteende hörtrösklar (= audiogram ¹⁰⁾ och auditiva fantom percepts som subjektiv tinnitus ^11. Speciellt de senare mätningarna i fokus för flera nya rapporter ^8,12,13,14 och kan ses som en förutsättning för elektrofysiologiska undersökningar av de neuronala mekanismerna bakom denna sjukdom. Med denna metod är det möjligt skilja vilka djur har utveckla en subjektiv tinnitus percept efter akustisk trauma och de som inte gjorde det, och sedan ytterligare utreda dessa individer, t.ex. med elektrofysiologiska inspelningar i primär hörselbarken.

Ett kritiskt steg i analysen av skrämmer data efter akustisk trauma är en normalisering av data till den skrämma amplitud som kanmaximalt framkallas utan föregående prov stimulans: Detta är särskilt viktigt att skilja minskade skrämmer svar baserade på hörselnedsättning av minskad PPI i tinnitus djur: Effekterna av den akustiska traumat förändras över tiden, eftersom djuret delvis återhämtar sig från det, men ungefär 50 % av hörselnedsättning är permanent. I motsats till rapporter som nämns ovan, där auditiva tröskelvärdena testas men inte används för kalibrering, försökte vi minimera effekterna av de olika hörtrösklar för varje frekvens och effekten av den akustiska trauma själva genom att normalisera varje svar amplitud med en referens. Dessutom använder vi två olika typer av protokoll för att bedöma eventuella tinnitus percept, med den första (4,4) arbetar bättre för djur som testats över längre tidsskalor från en vecka efter traumat på och den andra "klassiska" (4,5) arbetar bättre för djur som testats inom en vecka efter traumat.

En begränsning av denna metod är Clearly att man inte kan bedöma de akuta effekterna av en akustisk trauma. Minst två dagar mellan anestesi och den första post-mätningen bör väljas, eftersom djuret måste återhämta sig från det. För att få en uppskattning av akut hörselnedsättning direkt efter trauma (BERA) hjärnstammen audiometri kan användas.