Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l'aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l'enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d'étiquetage efficace et spécifique permet l'enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.
5-méthylcytosine (5-mC) constitue ~ 2-8% des cytosines total dans l'ADN génomique humain et affecte une large gamme de fonctions biologiques, y compris l'expression des gènes, le maintien de l'intégrité du génome, empreinte parentale, inactivation du chromosome X, la réglementation des développement, le vieillissement et le cancer 1. Récemment, la présence d'un 5-mC oxydé, 5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC), a été découvert dans les cellules de mammifères, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ES) et de cellules neuronales 2-4. 5-HMC est généré par l'oxydation du 5-mC catalysée par TET famille du fer (II) / α-cétoglutarate en fonction de dioxygénases 2, 3. 5-HMC est proposé de participer à l'entretien de souches embryonnaires (MES) cellulaire, hématopoïèse normale et les tumeurs malignes et le développement du zygote 2, 5-10. Afin de mieux comprendre la fonction de la 5-HMC, un système de séquençage fiable et simple est essentielle. Séquençage bisulfite traditionnelle ne peut pas distinguer 5-5-console HMC à partir MC 11 </sup>. Pour élucider la biologie de la 5-HMC, nous avons développé une approche chimique très efficace et sélective d'étiqueter et de capturer 5-HMC, profitant d'une enzyme bactériophage qui ajoute une fraction de glucose à 5 HMC spécifiquement 12.
Nous décrivons ici une simple procédure en deux étapes pour l'étiquetage chimique sélective de la 5-HMC. Dans la première étape de marquage, le 5-HMC dans l'ADN génomique est marqué avec un azide catalysée 6-β-glucose par-GT, une glucosyltransférase du bactériophage T4, d'une manière qui transfère le 6-azide-glucose à 5-HMC de l' modifié cofacteur, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Dans l'étape, biotinylation seconde, une liaison disulfure biotine est fixé au groupe azide par click chemistry. Ces deux étapes sont très spécifiques et efficace, conduisant à compléter l'étiquetage quelle que soit l'abondance de la 5-HMC dans des régions génomiques et en donnant de fond extrêmement faible. Après biotinylation de 5-HMC, les fragments d'ADN 5-HMC contenant sont ensuite sélectivement capturéen utilisant des billes de streptavidine d'une manière indépendante de la densité. Les résultantes 5-HMC-enrichis fragments d'ADN peuvent être utilisés pour les analyses en aval, y compris séquençage de prochaine génération.
Notre marquage sélectif et le protocole de capture confère une sensibilité élevée, applicable à toute source d'ADN génomique avec des variables / 5 diversifiée HMC abondance. Bien que le but principal de ce protocole est son application en aval (., Séquençage de prochaine génération de cartographier la distribution 5-HMC dans le génome), il est compatible avec une seule molécule, en temps réel SMRT (ADN) séquençage, qui est capable de fournir séquençage résolution d'une seule base de 5-HMC.
5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC) est une modification présente récemment identifié épigénétique en quantités importantes dans certains types de cellules de mammifères. La méthode présentée ici est de déterminer la distribution du génome entier de 5-HMC. Nous utilisons bactériophage T4 β-glucosyltransférase de transférer une fraction de glucose ouvragée contenant un groupe azide sur le groupe hydroxyle de 5-HMC. Le groupe azide peut être modifié chimiquement avec de la biotine pour la détection, l…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (GM071440 au CH et NS051630/MH076090/MH078972 à PJ).
Name | Company | Catalog # | Comment |
Reagents | |||
5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
Streptavidin C1 | |||
Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
Enzyme | |||
β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
Equipment | |||
Sonication device | Covaris | ||
Desktop centrifuge | |||
Water bath | Fisher Scientific | ||
Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |