Beskrevet er en to-stegs etiketteringsprosessen hjelp β-glucosyltransferase (β-GT) for å overføre en azid-glukose til 5-HMC, etterfulgt av klikk kjemi å overføre en biotin linker for enkel og tetthet uavhengig berikelse. Denne effektive og spesifikke merking metoden muliggjør berikelse av 5-HMC med ekstremt lav bakgrunn og høy gjennomstrømning epigenomic kartlegging via neste generasjons sekvensering.
5-methylcytosine (5-mC) utgjør ~ 2-8% av de totale cytosines i humant genomisk DNA og påvirker et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert genekspresjon, vedlikehold av genom integritet, foreldrenes imprinting, X-kromosom inaktivering, regulering av utvikling, aldring og kreft en. Nylig, ble tilstedeværelsen av et oksydert 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), oppdaget i pattedyrceller, spesielt i embryonale stamceller (ES-celler) og neuronale celler 2-4. 5-HMC genereres ved oksidasjon av 5-mC katalysert av TET family jern (II) / α-ketoglutarat-avhengige 2 dioxygenases, 3. 5-HMC er foreslått å være involvert i vedlikehold av embryonale stamceller (MES) celle, normal hematopoiesis og maligniteter, og zygote utvikling 2, 5-10. For bedre å forstå funksjonen av 5-HMC, er en pålitelig og grei sekvensering system viktig. Tradisjonell bisulfite sekvensering kan ikke skille 5-HMC fra 5-mC 11 </sup>. Å løse biologi 5-HMC, har vi utviklet en svært effektiv og selektiv kjemiske tilnærming til å merke og ta 5-HMC, dra nytte av en bakteriofag enzym som legger en glukose moiety til 5-HMC spesielt 12.
Her beskriver vi en grei totrinns prosedyre for selektiv kjemisk merking av 5-HMC. I det første trinnet merking, er 5-HMC i genomisk DNA merket med en 6-azide-glukose katalysert av β-GT, en glucosyltransferase fra T4 bakteriofag, på en måte som overfører 6-azide-glukose til 5-HMC fra modifisert cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andre trinn, biotinylation, en disulfid biotin linkerarm festet til azid-gruppen ved klikk kjemi. Begge trinnene er meget spesifikke og effektive, fører til fullstendig merking uansett overflod av 5-HMC i genomisk regioner og gi ekstremt lav bakgrunn. Etter biotinylation av 5-HMC, de 5-HMC-holdige DNA-fragmenter blir deretter selektivt fangetbruker streptavidin perler i en tetthet-uavhengig måte. De resulterende 5-HMC-beriket DNA fragmenter kan bli brukt for nedstrøms analyser, inkludert neste generasjons sekvensering.
Vår selektiv merking og fangst protokollen confers høy følsomhet, gjelder enhver kilde til genomisk DNA med variable / diverse 5-HMC abundances. Selv om hovedformålet med denne protokollen er dens nedstrøms søknaden (ie., Neste generasjons sekvensering å kartlegge 5-HMC distribusjon i genomet), er den kompatibel med single-molekyl, real-time SMRT (DNA) sekvensering, som er stand til å levere ett-grunnoppløsningen sekvensering av 5-HMC.
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) er et nylig identifisert epigenetic modifikasjon tilstede i betydelige mengder i visse pattedyr celletyper. Metoden som presenteres her er for å bestemme genom-wide distribusjon av 5-HMC. Vi bruker T4 bakteriofag β-glucosyltransferase å overføre en konstruert glukose moiety inneholdende en azide gruppe på hydroksylgruppen av 5-HMC. Azidet gruppen kan være kjemisk modifisert med biotin for deteksjon, affinitet berikelse, og sekvensering av 5-HMC-holdige DNA-fragmenter i pattedyr geno…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet i en del av National Institutes of Health (GM071440 til CH og NS051630/MH076090/MH078972 til PJ).
Name | Company | Catalog # | Comment |
Reagents | |||
5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
Streptavidin C1 | |||
Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
Enzyme | |||
β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
Equipment | |||
Sonication device | Covaris | ||
Desktop centrifuge | |||
Water bath | Fisher Scientific | ||
Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |