Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

Summary

Beskrivs är en tvåstegsprocess märkning med användning β-glukosyltransferas (β-GT) för att överföra en azid-glukos till 5-HMC, följt genom att klicka kemi för att överföra en biotin linker för enkel och densitet oberoende anrikning. Denna effektiva och särskild märkning metod möjliggör anrikning av 5-HMC med extremt låg bakgrund och hög genomströmning epigenomic kartläggning via nästa generations sekvensering.

Abstract

5-metylcytosin (5-MC) utgör ~ 2-8% av de totala cytosiner i human genomisk DNA och påverkar ett brett utbud av biologiska funktioner, inklusive genuttryck, underhåll av genomet integritet, föräldrarnas prägling, X-kromosom inaktivering, reglering av utveckling, åldrande och cancer ^1. Nyligen har närvaron av en oxiderad 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), upptäcktes i däggdjursceller, i synnerhet i embryonala stamceller (ES)-celler och neuronala celler ^2-4. 5-HMC alstras genom oxidation av 5-mC katalyserad av TET familjen järn (II) / α-ketoglutarat-beroende dioxygenases ^{2, 3.} 5-HMC föreslås delta i upprätthållandet av embryonala stamceller (MES) cell, normal hematopoes och maligniteter och zygot utveckling ^{2, 5-10.} För att bättre förstå funktionen av 5-HMC, är en tillförlitlig och enkel sekvenseringssystem väsentlig. Traditionell bisulfit sekvensering kan inte skilja 5-HMC från 5-mC ¹¹ </sup>. Att riva upp biologi 5-HMC, har vi utvecklat en mycket effektiv och selektiv kemisk metod att märka och fånga 5-HMC, dra nytta av en bakteriofag enzym som ger en glukosenhet till 5-HMC specifikt ^12.

Här beskriver vi en enkel två-stegsförfarande för selektiv kemisk märkning av 5-HMC. I det första märkning steget, är 5-HMC i genomiskt DNA märkt med en 6-azid-glukos katalyseras av β-GT, en glukosyltransferas från T4 bakteriofag, på ett sätt som överför 6-azid-glukos till 5-HMC från modifierad cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andra steget, biotinylering, är en disulfid biotin linker fäst till azidgruppen genom att klicka kemi. Båda stegen är mycket specifika och effektiva, vilket leder till fullständig märkning oavsett överflöd av 5-HMC i genomiska regioner och ger extremt låg bakgrund. Efter biotinylering av 5-HMC, de 5-HMC-innehållande DNA-fragment därefter selektivt fångasmed streptavidinpärloma i en täthet-oberoende sätt. De resulterande 5-HMC-anrikade DNA-fragment kan användas för nedströms analyser, inklusive nästa generations sekvensering.

Vår selektiva märkning och fånga protokoll ger hög känslighet, som gäller för alla källor av genomiskt DNA med varierande / varierande 5-HMC abundances. Även om det huvudsakliga syftet med detta protokoll är dess nedströms tillämpning (dvs.., Nästa generations sekvensering att kartlägga 5-HMC distribution i genomet), är den kompatibel med enda molekyl, i realtid SMRT (DNA) sekvensering, som är kan leverera enkel-bas upplösning sekvensering av 5-HMC.

Protocol

1. Genomiskt DNA Fragmentering Fragment genomiskt DNA med användning av sonikering i ett önskat storleksområde lämpad för genomet hela sekvensering plattform. (Vi brukar sonikera till ~ 300 bp). Kontrollera storleken fördelningen av fragmenterade genomiska DNA på 1% agarosgel (figur 1). 2. DNA-preparation Bestäm utgångspunkterna DNA mängder baserat på det överflöd av 5-HMC i genomisk DNA. Eftersom 5-HMC varie…

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) är en nyligen identifierad epigenetiska modifiering föreligger i väsentliga mängder i vissa däggdjurscelltyper. Den metod som presenteras här är för att bestämma genomet bred distribution av 5-HMC. Vi använder T4 bakteriofag β-glukosyltransferas att överföra en manipulerad glukosenhet innehållande en azidgrupp till hydroxylgruppen av 5-HMC. Azidgruppen kan modifieras kemiskt med biotin för detektering, affinitetsanrikning och sekvensering av 5-HMC-innehållande DNA-fragment…

Materials

Name	Company	Catalog #	Comment
			Reagents
5M Sodium chloride (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate	Click Chemistry Tools	A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Column	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipment
Sonication device	Covaris
Desktop centrifuge
Water bath	Fisher Scientific
Gel running apparatus	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Magnetic Separation Stand	Promega	Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).