Summary

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

Published: October 05, 2012
doi:

Summary

Beskrivs är en tvåstegsprocess märkning med användning β-glukosyltransferas (β-GT) för att överföra en azid-glukos till 5-HMC, följt genom att klicka kemi för att överföra en biotin linker för enkel och densitet oberoende anrikning. Denna effektiva och särskild märkning metod möjliggör anrikning av 5-HMC med extremt låg bakgrund och hög genomströmning epigenomic kartläggning via nästa generations sekvensering.

Abstract

5-metylcytosin (5-MC) utgör ~ 2-8% av de totala cytosiner i human genomisk DNA och påverkar ett brett utbud av biologiska funktioner, inklusive genuttryck, underhåll av genomet integritet, föräldrarnas prägling, X-kromosom inaktivering, reglering av utveckling, åldrande och cancer 1. Nyligen har närvaron av en oxiderad 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), upptäcktes i däggdjursceller, i synnerhet i embryonala stamceller (ES)-celler och neuronala celler 2-4. 5-HMC alstras genom oxidation av 5-mC katalyserad av TET familjen järn (II) / α-ketoglutarat-beroende dioxygenases 2, 3. 5-HMC föreslås delta i upprätthållandet av embryonala stamceller (MES) cell, normal hematopoes och maligniteter och zygot utveckling 2, 5-10. För att bättre förstå funktionen av 5-HMC, är en tillförlitlig och enkel sekvenseringssystem väsentlig. Traditionell bisulfit sekvensering kan inte skilja 5-HMC från 5-mC 11 </sup>. Att riva upp biologi 5-HMC, har vi utvecklat en mycket effektiv och selektiv kemisk metod att märka och fånga 5-HMC, dra nytta av en bakteriofag enzym som ger en glukosenhet till 5-HMC specifikt 12.

Här beskriver vi en enkel två-stegsförfarande för selektiv kemisk märkning av 5-HMC. I det första märkning steget, är 5-HMC i genomiskt DNA märkt med en 6-azid-glukos katalyseras av β-GT, en glukosyltransferas från T4 bakteriofag, på ett sätt som överför 6-azid-glukos till 5-HMC från modifierad cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andra steget, biotinylering, är en disulfid biotin linker fäst till azidgruppen genom att klicka kemi. Båda stegen är mycket specifika och effektiva, vilket leder till fullständig märkning oavsett överflöd av 5-HMC i genomiska regioner och ger extremt låg bakgrund. Efter biotinylering av 5-HMC, de 5-HMC-innehållande DNA-fragment därefter selektivt fångasmed streptavidinpärloma i en täthet-oberoende sätt. De resulterande 5-HMC-anrikade DNA-fragment kan användas för nedströms analyser, inklusive nästa generations sekvensering.

Vår selektiva märkning och fånga protokoll ger hög känslighet, som gäller för alla källor av genomiskt DNA med varierande / varierande 5-HMC abundances. Även om det huvudsakliga syftet med detta protokoll är dess nedströms tillämpning (dvs.., Nästa generations sekvensering att kartlägga 5-HMC distribution i genomet), är den kompatibel med enda molekyl, i realtid SMRT (DNA) sekvensering, som är kan leverera enkel-bas upplösning sekvensering av 5-HMC.

Protocol

1. Genomiskt DNA Fragmentering Fragment genomiskt DNA med användning av sonikering i ett önskat storleksområde lämpad för genomet hela sekvensering plattform. (Vi brukar sonikera till ~ 300 bp). Kontrollera storleken fördelningen av fragmenterade genomiska DNA på 1% agarosgel (figur 1). 2. DNA-preparation Bestäm utgångspunkterna DNA mängder baserat på det överflöd av 5-HMC i genomisk DNA. Eftersom 5-HMC varie…

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) är en nyligen identifierad epigenetiska modifiering föreligger i väsentliga mängder i vissa däggdjurscelltyper. Den metod som presenteras här är för att bestämma genomet bred distribution av 5-HMC. Vi använder T4 bakteriofag β-glukosyltransferas att överföra en manipulerad glukosenhet innehållande en azidgrupp till hydroxylgruppen av 5-HMC. Azidgruppen kan modifieras kemiskt med biotin för detektering, affinitetsanrikning och sekvensering av 5-HMC-innehållande DNA-fragment…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes delvis av National Institutes of Health (GM071440 till CH och NS051630/MH076090/MH078972 PJ).

Materials

Name Company Catalog # Comment
Reagents
5M Sodium chloride (NaCl) Promega V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Promega V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5 Invitrogen 15567-027)
HEPES 1M, pH7.4 Invitrogen 15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M Ambion AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate Click Chemistry Tools A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure Invitrogen 15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen 28304
Micro Bio-Spin 6 Column Bio-Rad 732-6222
Dynabeads MyOne Invitrogen 650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
UDP-6-N3-glucose Active Motif 55013
Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT) New England Biolab M0357
Equipment
Sonication device Covaris
Desktop centrifuge
Water bath Fisher Scientific
Gel running apparatus Bio-Rad
NanoDrop1000 Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker Barnstead
Labquake Tube Shaker Thermolyne
Magnetic Separation Stand Promega Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , 245-254 (2003).
  2. Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
  3. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
  6. Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
  7. Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
  8. Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
  9. Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
  10. Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
  11. Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
  12. Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
  13. Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
  14. Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
  15. Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
  16. Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochemistry. , (2012).
  17. Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
  18. Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
  19. Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
  20. Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
  21. Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).

Play Video

Cite This Article
Li, Y., Song, C., He, C., Jin, P. Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA. J. Vis. Exp. (68), e4441, doi:10.3791/4441 (2012).

View Video