Beskrives en totrins-mærkning ved anvendelse β-glucosyltransferase (β-GT) for at overføre et azid-glucose til 5-HMC, efterfulgt af klik kemi til at overføre en biotin linker til nem og densitet-uafhængig berigelse. Denne effektive og specifikke mærkning metode gør det muligt berigelse af 5-HMC med ekstremt lav baggrund og højkapacitetsidentifikation epigenomic kortlægning via næste generation sekventering.
5-methylcytosin (5-Mc) udgør ~ 2-8% af de samlede cytosiner i human genomisk DNA og påvirker en lang række biologiske funktioner, herunder genekspression, vedligeholdelse af genom integritet, parentale prægning, X-kromosom inaktivering, regulering af udvikling, aldring og kræft 1. For nylig blev tilstedeværelsen af en oxideret 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), fundet i mammale celler, især i embryostamceller (ES) celler og neuronale celler 2-4. 5-HMC genereres ved oxidationen af 5-mC katalyseret af TET familien jern (II) / α-ketoglutarat-afhængig dioxygenases 2, 3. 5-HMC foreslås at være involveret i vedligeholdelse af embryonale stamceller (MES) celle, normal hæmatopoiese og maligniteter, og zygote udvikling 2, 5-10. For bedre at forstå funktionen af 5-HMC, en pålidelig og enkel sekventering er afgørende. Traditionel bisulfit sekventering kan ikke skelne 5-HMC fra 5-MC 11 </sup>. At optrævle biologi 5-HMC, har vi udviklet en meget effektiv og selektiv kemisk tilgang til at mærke og fange 5-HMC, at drage fordel af en bakteriofag enzym, der tilføjer en glucosedel til 5-HMC specifikt 12.
Her beskriver vi en simpel totrinsprocedure til selektiv kemisk mærkning af 5-HMC. I det første mærkning trin 5-HMC i genomisk DNA mærket med en 6-azid-glucose katalyseret af β-GT, en glucosyltransferase fra T4-bakteriofag på en måde, som overfører 6-azid-glucose til 5-HMC fra modificeret cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). I det andet trin, biotinylering, er en disulfid biotin-linker bundet til azidgruppen af klik kemi. Begge trin er særdeles specifikke og effektive, hvilket fører til fuldstændig mærkning uanset forekomsten af 5-HMC i genomiske regioner og give yderst lav baggrund. Efter biotinylering af 5-HMC, de 5-HMC-holdige DNA-fragmenter derefter selektivt fangetved hjælp af streptavidin-perler i en densitet-uafhængig måde. De resulterende 5-HMC-berigede DNA-fragmenter kan anvendes til efterfølgende analyser, herunder næste generation sekventering.
Vores selektiv mærkning og capture-protokol giver høj følsomhed, der gælder for enhver kilde til genomisk DNA med variable / diverse 5-HMC overflod. Selvom hovedformålet med denne protokol er dens downstream anvendelse (dvs.., Næste generation sekventering at kortlægge 5-HMC distribution i genomet), det er foreneligt med enkelt-molekyle, real-time SMRT (DNA) sekventering, der er kan levere single-base opløsning sekventering af 5-HMC.
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) er en nylig identificeret epigenetisk modifikation til stede i væsentlige mængder i visse mammale celletyper. Metoden, der præsenteres her, er til bestemmelse af genom-dækkende udbredelse af 5-HMC. Vi anvender T4 bakteriofag β-glucosyltransferase at overføre en manipuleret glucosedel indeholder en azidgruppe på hydroxylgruppen i 5-HMC. Af azidgruppen kan modificeres kemisk med biotin til påvisning, affinitetsberigelse, og sekventering af 5-HMC-holdige DNA-fragmenter i mammale geno…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet delvist af National Institutes of Health (GM071440 til CH og NS051630/MH076090/MH078972 til PJ).
Name | Company | Catalog # | Comment |
Reagents | |||
5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
Streptavidin C1 | |||
Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
Enzyme | |||
β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
Equipment | |||
Sonication device | Covaris | ||
Desktop centrifuge | |||
Water bath | Fisher Scientific | ||
Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |