תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.
5-methylcytosine (5-MC) מהווה ~ 2-8% מכלל cytosines בהדנ"א הגנומי אדם ומשפיע על מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ביטוי גנים, שמירה על שלמות הגנום, החתמה הורית, איון כרומוזום ה-X, רגולציה של פיתוח, הזדקנות וסרטן 1. לאחרונה, הנוכחות של חומץ 5-MC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), התגלתה בתאי יונקים, ובעיקר בתאי גזע עובריים (ES) ותאים עצביים 2-4. 5-HMC נוצר על ידי חמצון של 5-MC קטליזאטור ידי ט משפחת הברזל (ב ') / dioxygenases α-ketoglutarate התלוי 2, 3. 5-HMC מוצע להיות מעורב בתחזוקה של תא גזע עוברי (MES), hematopoiesis וממאירויות הרגילים, והזיגוטה פיתוח 2, 5-10. כדי להבין טוב יותר את התפקוד של 5-HMC, מערכת רצף אמינה וישירה היא חיונית. רצף יסולפיט מסורתי לא מבחין בין 5-5-HMC מMC 11 </sup>. כדי להסביר את הביולוגיה של 5-HMC, פתח גישה כימית יעילה מאוד סלקטיבית לתייג וללכוד 5-HMC, תוך ניצול של אנזים bacteriophage שמוסיף מחצית סוכר ל5-HMC במיוחד 12.
כאן אנו מתארים הליך פשוט שני שלבים לתיוג כימי סלקטיבית של 5-HMC. בשלב התיוג 1, 5-HMC בהדנ"א הגנומי מתויג עם קטליזאטור 6-יזיד-גלוקוז על ידי β-GT, glucosyltransferase מbacteriophage T4, באופן שמעביר את 6-תזיד-גלוקוז ל5-HMC מ העדכון cofactor, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). בצעד, biotinylation השני, מקשר ביוטין דיסולפיד מצורף לקבוצה יזיד ידי לחץ כימיה. שני פעולות ספציפיות ויעילות ביותר, שמובילות לתיוג להשלים ללא קשר לשפע של 5-HMC באזורים גנטיים ונותנים רקע נמוך ביותר. בעקבות biotinylation של 5-HMC, שברי 5-DNA המכיל HMC אז הם כבשו סלקטיביבאמצעות חרוזי streptavidin באופן עצמאי בצפיפות. שברי 5-HMC מועשרי DNA המתקבלים יכולים לשמש עבור ניתוחים במורד זרם, כוללים רצף של הדור הבא.
התיוג סלקטיבית שלנו ופרוטוקול לכידה מקנים רגישות גבוהה, החלה על כל מקור של הדנ"א הגנומי עם שכיחות משתנית / 5-HMC מגוון. אמנם המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא יישומה במורד הזרם (כלומר., הדור הבא של רצף למפות את התפלגות 5-HMC בגנום), זה תואם עם מולקולה בודדה, SMRT (DNA) רצף בזמן אמת, שהוא מסוגל לספק רזולוצית רצף יחיד בסיס של 5-HMC.
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) הוא הווה שינוי epigenetic זיהה לאחרונה בכמויות ניכרות בסוגי תאי יונקים מסוימים. השיטה שהוצגה כאן היא לקביעת חלוקת הגנום של 5-HMC. אנו משתמשים bacteriophage T4 β-glucosyltransferase להעביר מחצית גלוקוז מהונדסת המכילה קבוצה תזיד על קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC. הקבוצה תזיד יכולה לה…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (GM071440 לCH וNS051630/MH076090/MH078972 לPJ).
Name | Company | Catalog # | Comment |
Reagents | |||
5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
Streptavidin C1 | |||
Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
Enzyme | |||
β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
Equipment | |||
Sonication device | Covaris | ||
Desktop centrifuge | |||
Water bath | Fisher Scientific | ||
Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |