Summary

Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы

Published: October 14, 2012
doi:

Summary

Данное исследование описывает процедуры создания новых нейронных аксонов и (ASTRO) глии совместного культивирования платформы. В этой совместной системе культуры, манипуляции прямого взаимодействия между одним аксона (и единственной глиальных клеток) становится возможным, позволяя механистического анализа взаимного нейрона к глиальных сигнализации.

Abstract

Правильное нейрона к глии взаимодействие имеет решающее значение для физиологических функций центральной нервной системы (ЦНС). Это двусторонняя связь изощренно опосредовано конкретных сигнальных путей между нейроном и глии 1,2. Идентификация и характеристика этих сигнальных путей имеет важное значение для понимания того, как нейрон глия взаимодействия физиологии ЦНС формы. Ранее нейронов и глии смешанных культур были широко использованы для тестирования и характеризующие сигнальные пути между нейроном и глии. То, что мы узнали из этих препаратов и других инструментов в естественных условиях, однако, предположил, что взаимное сигнализации между нейроном и глии часто происходило в конкретных отделений в нейронах (т.е., аксон, дендритов, или сома) 3. Это делает его важным для разработки новой системы культуры, которые позволяют разделение отсеков нейронов и, в частности исследует взаимодействие между глии и нейровнутренней аксоны / дендритов. Кроме того, обычные смешанной системе культуры не способны дифференцироваться растворимых факторов и прямой контакт мембраны сигналы между нейроном и глии. Кроме того, большое количество нейронов и глиальных клеток в обычных совместного культивирования системе отсутствует разрешение, необходимое для наблюдения за взаимодействием между одним аксонов и глиальных клеток.

В этой работе мы описываем новую аксонов и глии совместного культивирования системы с использованием платформы микрофлюидных культуре (MCP). В этой совместного культивирования системы, нейроны и глиальные клетки культивируют в двух отдельных камер, которые подключены через несколько центральных каналов. В этом микрофлюидных платформе культуры, только нейронных процессов (особенно аксоны) может войти в глиальных стороне через центральные каналы. В сочетании с мощной флуоресцентной маркировки белков, эта система позволяет непосредственного изучения сигнальных путей между аксональной / дендритные и глиальные взаимодействия, такие,с аксон-опосредованной регуляции транскрипции в глии, глия-опосредованной рецепторами нейронов торговли терминалы, и глии-опосредованного роста аксонов. Узкого диаметра камеры также значительно запрещает поток нейронов обогащенной среды в глиальных камеры, облегчая зондирования прямого мембранного белка взаимодействия между аксонами / дендритов и глиальных поверхности.

Protocol

1. Собрание Микрофлюидных палата культуры (MCP) MCP (рис. 1) открытые камеры предназначены для отсеки культур разных типов клеток 4. Она обычно состоит из двух отсеков, которые подключены через центральные каналы (3 мкм в диаметре). Собрания MCP со стеклянным дном блюда необ…

Representative Results

Время изображений в заданный промежуток анализ Аксон-индуцированной GLT1 промоутер активации астроцитов Отсеки нейронов и астроцитов совместного культивирования система позволяет только нейронных процессов, особенно аксоны, чтобы избирательно взаимодействовать с астр…

Discussion

MCP на основе нейронов и астроцитов совместного культивирования система позволяет рассечение подробную нейрона к астроглии сигнальных путей, позволяя только аксоны проходят центральные каналы и взаимодействия с астроглиальных клеток. Это сотрудничество культура система может быть л…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить д-р Джеффри Ротштейн для обеспечения BAC GLT1 УЗФБ мышей и GLT1 антитела; Тафтса Центр Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) за ценные объекты ядра; Новый факультет набора гранта (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Фил Хей) в Тафтса Neuroscience департамента.

Materials

Fetal bovine serum Hyclone SH30070.03 for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F4135 for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor R&D systems 212-GD Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose Sigma-Aldrich 11995  
70 mm cell strainer BD Falcon 352350  
Sterile glass bottom dish MatTek Corporation    
Microfluidic culture platforms Xona Microfluidics LLC SND150  
6 wells of the culture plate Cellstar 657 160  
     

Neuron culture medium

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin
     

Neuron culture medium for plating cell

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin
  • 5% Fetal bovine serum SH30070.03
     

Astrocyte culture medium

  • Dulbecco modified eagle medium high glucose
  • 10% Fetal bovine serum F4135
  • 1% Penicillin-streptomysin
     

Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.

References

  1. Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
  2. Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
  3. Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
  4. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
  5. Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
  6. Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
  7. Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
  8. Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
  9. Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
  10. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
  11. Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
  12. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
  13. Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).

Play Video

Cite This Article
Higashimori, H., Yang, Y. Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System. J. Vis. Exp. (68), e4448, doi:10.3791/4448 (2012).

View Video