Denne undersøgelse beskriver procedurerne for at oprette en ny neuronal axon og (astro) glia co-kultur platform. I dette co-kultursystem, bliver manipulation af direkte interaktion mellem en enkelt axon (og enkelt gliacelle) mulig, således mekanistisk analyse af den gensidige neuron til gliale signalering.
Korrekt neuron at glia interaktion er kritisk for fysiologiske funktion af centralnervesystemet (CNS). Denne tovejskommunikation er sofistikerede medieret af specifikke signalveje mellem neuron og glia 1,2. Identifikation og karakterisering af disse signalveje er afgørende for forståelsen af, hvordan neuron til glia interaktion figurer CNS fysiologi. Tidligere har neuron-og glia blandede kulturer været almindeligt anvendt til afprøvning og karakterisering af signalveje mellem neuron-og glia. Hvad vi har lært af disse præparater og andre in vivo værktøjer har dog foreslået, at de gensidige signalering mellem neuron og glia ofte forekom i specifikke rum i neuroner (dvs. axon, dendritceller, eller soma) 3. Det gør det vigtigt at udvikle en ny kultur, der tillader adskillelse af neuronale rum og specifikt undersøger samspillet mellem glia og neuronale axoner / dendritter. Endvidere er den konventionelle blandede kultursystem ikke individualisere de opløselige faktorer og direkte membran kontaktsignaler mellem neuron-og glia. Det store antal neuroner og gliaceller i den konventionelle co-kultur-systemet mangler opløsningen nødvendigt at observere interaktionen mellem en enkelt axon og en gliacelle.
I denne undersøgelse beskriver vi en hidtil ukendt axon-og glia co-dyrkningssystem med anvendelse af en mikrofluid kultur platform (MCP). I dette co-kultursystem er neuroner og gliaceller dyrket i to separate kamre, der er forbundet gennem flere centrale kanaler. I denne microfluidic kultur platform, kan der kun neuronale processer (især axoner) indtast den glial side gennem de centrale kanaler. I kombination med kraftige fluorescerende protein mærkning, tillader dette system direkte undersøgelse af signalveje mellem axonale / dendritisk og glial interaktioner, sådans axon-transkriptionel regulering i glia, glia-medieret receptor handel i neuronale terminaler, og glia-medierede Axon vækst. Den snævre diameter af kammeret også signifikant forbyder strømmen af neuron-beriget medium ind i glia kammer, lette probning af den direkte membran-protein-interaktion mellem axoner / dendritter og glial overflader.
MCP baserede neuron og astrocytter co-kultur system tillader dissektion af detaljerede neuron til astroglia signalveje ved kun at tillade axonerne passerer de centrale kanaler og interaktion med astrogliale celler. Denne co-kultursystem kan hensigtsmæssigt konfigureres med konventionelle neuron og astrocyt kultur procedurer. Vi beskrev også en praktisk anvendelse af denne co-kultur ved at ansætte en eGFP baseret reporter for at demonstrere axon-afhængig GLT1 promotoraktivering i astrocytter.
<p class="jove_conte…The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Jeffrey Rothstein for at give BAC GLT1 eGFP mus og GLT1 antistof, Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) til at give værdifulde core faciliteter, New fakultet rekruttering tilskud (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) i Tufts Neuroscience afdeling.
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
Neuron culture medium for plating cell
|
|||
Astrocyte culture medium
|
|||
Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |