Denne studien beskriver prosedyrene for å sette opp en ny neuronal axon og (astro) gliaceller co-kultur plattform. I dette samarbeidet kultur systemet, blir manipulering av direkte interaksjon mellom en enkelt axon (og eneste glial celle) gjennomførbart, slik mekanistisk analyse av gjensidig nervecelle til glial signalering.
Riktig nervecelle til gliaceller interaksjon er kritisk til fysiologisk funksjon av sentralnervesystemet (CNS). Dette toveiskommunikasjon er sophisticatedly mediert av spesifikke signalveier mellom nevroner og gliaceller 1,2. Identifisering og karakterisering av disse signalveier er viktig for forståelsen av hvordan nervecelle til gliaceller interaksjon former CNS fysiologi. Tidligere har Nevron og gliaceller blandede kulturer blitt mye benyttet til testing og karakterisere signalveier mellom nevroner og gliaceller. Det vi har lært av disse preparatene og andre in vivo verktøy, har imidlertid antydet at gjensidige signalering mellom nevroner og gliaceller ofte skjedd i bestemte avdelinger innenfor nevroner (dvs. axon, dendrite eller soma) 3. Dette gjør det viktig å utvikle en ny kultur system som tillater separasjon av neuronal kamrene og spesielt undersøker samspillet mellom gliaceller og nevronale axons / dendritter. I tillegg er den konvensjonelle blandede kultur systemet ikke i stand til å differensiere de oppløselige faktorer og direkte membran kontakt signaler mellom nevroner og gliaceller. Videre mangler den store mengden av nevroner og gliaceller i konvensjonelle co-kultursystem oppløsningen nødvendig å observere samspillet mellom en enkelt axon og en glial celle.
I denne studien, beskriver vi en roman axon og gliaceller co-kultur-system med bruk av en microfluidic kultur plattform (MCP). I denne co-kultursystem, blir neuroner og gliaceller dyrket i to separate kamre som er forbundet via flere sentrale kanaler. I denne microfluidic kultur plattform, kan bare neuronal prosesser (spesielt axoner) inn i glial side gjennom de sentrale kanalene. I kombinasjon med kraftig fluorescerende protein merking, gjør dette systemet direkte undersøkelse av signalveier mellom aksonal / dendrittiske og glial interaksjoner, for eksempel ens axon-mediert transcriptional regulering i gliaceller, gliaceller-mediert reseptor menneskehandel neuronal terminaler, og gliaceller-mediert axon vekst. Den smale diameter av kammeret også forbyr signifikant flyten av neuron-anrikede medium til glial kammeret, tilrettelegging sondering av direkte membran-protein interaksjon mellom axoner / dendritter og glial overflater.
MCP baserte neuron og astrocytes co-kultur systemet tillater disseksjon av detaljert nervecelle til astroglia signalveier ved at bare axons passere de sentrale kanalene og samspill med astroglial celler. Dette samarbeidet kultur systemet kan enkelt settes opp med konvensjonell nevron og astrocyte kultur prosedyrer. Vi har også beskrevet en praktisk anvendelse av dette samarbeidet kultur systemet ved å bruke en eGFP basert reporter for å demonstrere axon-avhengige GLT1 promoter aktivering i astrocytes.
<p class="j…The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke dr. Jeffrey Rothstein for å gi BAC GLT1 eGFP mus og GLT1 antistoff, Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) for å gi verdifulle kjernefasiliteter, New fakultet rekruttering tilskuddet (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) i Tufts Neuroscience avdeling.
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
Neuron culture medium for plating cell
|
|||
Astrocyte culture medium
|
|||
Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |