Summary
Denna studie beskriver förfaranden för att inrätta en ny neuronal axon och (astro) Glia samodling plattform. I denna samodlingssystemet blir manipulering av direkt interaktion mellan en axon (och enda gliaceller) genomförbart, så mekanistiska analys av ömsesidiga neuron till gliala signalering.
Abstract
Korrekt neuron till glia växelverkan är kritisk för fysiologisk funktion hos det centrala nervsystemet (CNS). Denna dubbelriktad kommunikation är sofistikerat förmedlas av specifika signalvägar mellan neuron och glia 1,2. Identifiering och karakterisering av dessa signalvägar är avgörande för förståelsen av hur neuron till Glia interaktion former CNS fysiologi. Tidigare har neuron och glia blandade kulturer har allmänt används för att testa och karakterisera signalvägar mellan neuron och glia. Vad vi har lärt oss av dessa preparat och andra in vivo-verktyg har dock föreslagit att ömsesidiga signalering mellan neuron och glia ofta förekommit i vissa fack inom neuroner (dvs. axon, dendrit eller soma) 3. Detta gör det viktigt att utveckla en ny kultur som gör det möjligt separation av neuronala fack och specifikt undersöker samspelet mellan glia och neuronella axoner / dendriter. Dessutom, är det konventionella blandade kulturen systemet inte kan differentiera de lösliga faktorer och direkta membran signaler kontakt mellan neuron och glia. Dessutom saknar den stora mängden av neuroner och gliaceller i det konventionella samodlingssystemet den upplösning som krävs för att observera samspelet mellan en enda axon och en gliacell.
I denna studie beskriver vi en ny axon och glia samodlingssystemet med användning av en mikrofluidisk kultur plattform (MCP). I denna samodlingssystemet är neuroner och gliaceller odlades i två separata kammare som är anslutna via flera centrala kanaler. I denna mikroflödessystem kultur plattform, kan bara neuronala processer (särskilt axoner) Ange gliaceller sidan genom de centrala kanalerna. I kombination med kraftfulla fluorescerande protein märkning tillåter detta system direkt undersökning av signalvägar mellan axonala / dendritiska och gliaceller interaktioner, sådans axon-medierad transkriptionell reglering i glia, Glia-medierad receptor handel med neuronala terminaler och glia-medierad axon tillväxt. Den smala diametern av kammaren också signifikant förbjuder flödet av neuron-anrikat medium i gliala kammaren, underlättar sondering av direkta membran-protein-interaktion mellan axoner / dendriter och glia ytor.
Protocol
1. Montering av mikroflödessystem kultur avdelningen (MCP)
- MCP (fig. 1) är öppna kamrar utformade för fackindelad kulturer av olika typer av celler 4. Den har vanligen två fack som är anslutna genom de centrala kanalerna (3 pm i diameter). Montering av MCP med glas botten rätter är nödvändig för att förbereda kulturer och efterföljande bildanalys.
- Först, belägga sterila glas botten rätter med polyornitin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) upplöst i natriumtetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) och inkuberades över natten vid 37 ° C.
- På följande dag, de belagda glas botten rätter tvättades tre gånger med DDH 2 O och torkades under sterila dragskåp. De glas botten rätter var sedan ytterligare belagd med laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) och torkas under UV-ljus under 1 timme. Belagda rätter är färdiga att använda eller kan lagras vid -20 ° C fram till användning. Dessa beläggning av enre behövs för plätering neuroner och astrocyter i sam-kulturen.
- Att montera kultur plattformen har mikrofluidiska kultur plattformar ovanpå de belagda glas botten rätter med centrala anslutande kanaler på dess undre sida för att bilda en tät försegling. Regelbunden neuron eller astrocyt medier kultur tillsattes (från cell plating områdena) på båda sidor (figur 1) i den hopsatta MCP och inkuberades under 2-4 timmar vid 37 ° C, för att säkerställa att det finns inget läckage mellan MCP och glas- botten skålen. Vi har testat med medium före utstrykning celler att säkerställa att det inte finns någon läcka. Monteringen av MCP på glasbottnad maträtt bör beredas omedelbart innan användning.
2. Beredning av Neuronal kultur och induktion av neuronala axoner i Monterad MCP
- Kortikala neuronala cellkulturer nyberedda från embryonala 14-16 dagar gamla mus hjärnor. Neuron odlingsmedium sammansatt av Neurobasal-medium, 2% B27 neurobasaL tillägg, 2 mM glutamin genom att tillsätta 1% av 100x glutamax, och 1% penicillin-streptomysin. Efter dissektion av musen hjärnan var meningerna bort från hjärnbarken under dissekera mikroskop. Vävnaden hackades därefter med ett rakblad för att göra små vävnad block i syfte att öka den yta som utsätts för trypsin. Vävnadsblock trypsinerades (Sigma-Aldrich, 0,05% trypsin) under 10 min i en 37 ° C vattenbad, och sedan dissocieras försiktigt genom triturering med en brand-polerad pasteurpipett. Dissocierade celler filtrerades genom ett 70 | im sil för att samla tydlig neuronala cellsuspension.
- Neuroner (2-3 x 10 6 / ml, 150 pl) ströks ut på områdena cell plätering på höger sida (fig 1) av den sammansatta MCP så att neuroner kan fästa i cellen kvarhållande området (figur 1). Nyframställd neuroner ströks med neuron plätering medium som är kompletterat med 5% fetalt bovint serum (Hyclone) i förordR neuron odlingsmedium. Eftersom endast de neuroner som fäster i cellen kvarhållande området kan växa axoner i den andra sidan av den sammansatta MCP genom centrala kanaler, är det viktigt att plätera hög densitet av neuroner i cellen bordläggningen område för att säkerställa tillräckligt neuroner är kopplade till cell kvarhållande område. En representativ bild av hög densitet av neuronala axoner visas i figur 2A.
- På följande dag, neuron plätering mediet ersättas med regelbundna neuron odlingsmediet. Ändra medium åstadkoms genom försiktigt aspirera mediet från cellens bordläggningen området av kammaren, men inte från cellen kvarhållande området av den sammansatta MCP, i syfte att undvika luftbubblor i cellen kvarhållande området och de centrala anslutande kanalerna. Luftbubblor kommer att allvarligt hämma axonet utväxt och efterföljande inträde i de centrala kanalerna i MCP. Glia-cell härledd neurotrofisk faktor (GDNF, 10-20 ng / ml) tillsattes också på den andra (vänstra) sidaav kammaren på samma dag för att underlätta induktionen av utväxt axonet 5 från den neuronala sidan och kors genom centrala kanaler i den sammansatta MCP (fig 2A). Hel del spontana neuritutväxt utan GDNF också observeras från neuronala sidan och kors genom centrala kanaler i den sammansatta MCP. Axoner som kommer in i den centrala kanalen observeras ofta 2-3 dagar efter utstrykning. När axoner in i den centrala kanalen, anger de vanligtvis den andra sidan inom en dag. Axoner är normalt intakt i åtminstone en vecka efter att den andra sidan.
3. Tillsättning av Odlade Astrocyter till MCP för att upprätta en fack samodlingssystemet
Primära astrocyt odlingar framställdes från P1-3 mus valp hjärna. Hjärnan dissociation Förfarandet liknar den neuronala cellisolering procedur som beskrivits ovan. Astrocyter först klädd i 10 cm skål som pre-Belagd med polyornitin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). Den astrocyt odlingsmedium (DMEM, 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomysin) ändrades varje dag under de följande två dagarna för att avlägsna skräp. Därefter byttes mediet var tredje dag.
- Astrocyter blir 90% sammanflytande och bilda ett monoskikt efter 7 dagar. Konfluenta astrocyter trypsinerades och 150 ul resuspenderas astrocyter (1x10 6 / ml) åter klädd i cellen bordläggningen området till vänster på den monterade MCP när axoner är på väg in eller just in i vänstra sidan av den sammansatta MCP. Astrocyter var oftast klädd 4-5 dagar efter neuronerna var klädd. GDNF först bort innan re-plätering av astrocyterna in i den vänstra sidan av MCP. Re-pläterade astrocyter fästes i cellen kvarhållande området, såsom visas av GFAP immunofärgning (figur 1). Endast minimalt flöde av medium mellan de båda sidorna av kamrarna (bestämd genom fluorescens dja) hittades i MCP, såsom tidigare visats 4,6.
- Astrocyter blir 90% sammanflytande och bilda ett monoskikt efter 7 dagar. Konfluenta astrocyter trypsinerades och 150 ul åter suspenderade astrocyter (1 x 10 6 / ml) åter klädd i cellen bordläggningen området till vänster på den monterade MCP när axoner är på väg in eller har just gått in i den vänstra sida av den sammansatta MCP. Astrocyter var oftast klädd 4-5 dagar efter neuronerna var klädd. GDNF först bort innan re-plätering av astrocyterna in i den vänstra sidan av MCP. Re-pläterade astrocyter fästes i cellen kvarhållande området, såsom visas av GFAP immunofärgning (figur 1). Endast minimalt flöde av medium mellan de båda sidorna av kamrarna (bestämd genom fluorescens färgämnen) hittades i MCP, såsom tidigare visats 4,6.
- Efter re-plätering av astrocyter, axoner som trädde den vänstra sidan av den sammansatta MCP interagera direkt med Astrocytes av antingen direkt axonal kontakt eller utsläpp av lösliga faktorer. Immunfärgning av astrogliala plasmamembran glutamat transportör GLT1 och neuronal βIII-tubulin utfördes för att visualisera interaktionen mellan axoner och astrocyter de, som visas i figur 2D-F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Time-lapse avbildning analys av axon-inducerad GLT1 promotor aktivering i astrocyter
Den fackindelade neuron och astrocyt samodlingssystemet tillåter endast de neuronala processerna, särskilt axoner, för att selektivt interagera med astrocyter. Efter den framgångsrika etableringen av axon och astrocyt (eller andra gliaceller) sam-kultur i den sammansatta MCP, kan olika typer av axon-glia interaktioner studeras såsom, axon-inducerad aktivering av astrogliala genpromotor aktivering, astrocyt-inducerad Axon vägledning , axon-inducerad astrogliala Ca 2 + svar och axon-inducerad myelin syntes i oligodendrocyter. Alla dessa applikationer utnyttjar tillgången på kraftfulla fluorescerande reportrar för gliaceller eller färgämnen laddade till dessa celler.
Här beskriver vi axon-inducerad transkriptionsaktivering av astrogliala glutamat transportör 1 (GLT1) promotor genom bakteriell artificiell bestrukenvissa (BAC) GLT1 EGFP transgena möss och detta fack samodlingssystemet. I BAC GLT1 EGFP transgena möss, en EGFP reporter fluorescens överuttrycks under kontroll av GLT1 genomiska promotorn 7. Uttrycket av EGFP reportern korrelerar med endogen GLT1 promotor aktivering proteinuttryck och funktionell aktivitet 7 vilket möjliggör en bedömning av GLT1 promotoraktivitet i enstaka astrocyter in situ. Astrogliala GLT1 uttryck är starkt beroende av neuronal stimulering 6,8. Primära astrocyter uttrycker miniminivåer GLT1, men är GLT1 expressionsnivåer (både mRNA och protein) starkt induceras i astrocyter som samodlas med neuroner 9. Bevisen visas här genom att avsevärt öka GLT1 immunreaktivitet i fack samodlingssystemet (Figur 3). Vid konventionell neuron och astrocyt samkulturer, hög täthet av nervceller gör det mindre perfekt att observeraeffekt av neuronala axoner på den transkriptionella aktiveringen av GLT1 promotorn.
För övervakning av axon-beroende promotor GLT1 aktivering, vildtyp neuroner odlades i den högra sidan av den monterade MCP och axonerna inducerades efter tillämpningen av GDNF på den vänstra sidan av den sammansatta MCP. Astrocyter härledda från BAC GLT1 EGFP möss odlades i den vänstra sidan av den sammansatta MCP efter axoner har inducerats och bara in i den vänstra sidan av den sammansatta MCP. Totalt 6 dagar (24 h till 140 h) tidsförlopp bilderna uppsamlades för att övervaka EGFP fluorescensintensitet förändras i realtid och axontillväxt i MCP. Såsom visas i fig. 4A, var mycket minimal EGFP fluorescens expression i astrocyter observerades 24 h efter plätering av astrocyter. Signifikant ökning av EGFP intensitet observerades 48 timmar efter samodling (från 24 hr till 68 timmar) när axoner är väl i astrocyt sidan och interaktiont kontakt direkt med astrocyter (figur 4 f.Kr.). Å andra sidan var EGFP fluorescensintensitet successivt minskat när axoner var tillbakadragen och urartat i kainit (200 M) inducerad neuronal celldöd på den neuronala (höger) sida av den sammansatta MCP (Figur 4D-F). Den dynamiska förändringen av EGFP fluorescensintensitet som svar på axoner tydligt visat att astrogliala GLT1 promotoraktiviteten moduleras av axonet interaktionen.
Figur 1. Skiss av mikroflödessystem neuron och astrocyternas samodling plattform. Mikroflödessystem kultur plattform (MCP) har två fack som är anslutna via de centrala kanalerna. Celler kan pläteras från cellen plätering området på varje sida och neuronala axoner induceras från cellen kvarhållande området och passera genom de centrala kanalerna till ENTER den andra sidan (in skalstock 50 um).
Figur 2. Induktion av neuronala axoner och interaktion av axoner med astrocyt i MCP MCP. (A) Hög densitet av neuroner i cellen kvarhållande området av den monterade MCP, avslöjades genom βIII-tubulin immunfärgning. Skala bar: 50 m (B) förstorad bild av axoner korsar de centrala kanalerna och in i den andra sidan av MCP. Skalstock: 100 um (C) axontillväxt kon avslöjas av BIII-tubulin färgning när axoner in i den andra sidan av MCP. Skalstock: 100 um (D) Axon knippen som växer genom den centrala kanalen och in i den andra sidan av MCP. (E) Astrocyter framträder vid GLT1 immunfärgning i gliaceller sidan av MCP. (F) sammanslagna bilden visar kontakt mellan axoner och GLT1 positiva astrocyter. Skala bar: 50 pm.
Figur 3. Neuron-beroende induktion av GLT1 uttryck i primära astrocyter GLT1 immunoreaktivitet i (A) primära astrocyt kulturer, skala bar:. 50 pm (B) primära neuronala kulturer, och (C) primära neuron och astrocyt samkulturer. Skala bar: neuroner visas genom immunfärgning av βIII-tubulin. Signifikant ökning av GLT1 immunoreaktivitet observerades i neuron och astrocyt samkulturer.
Figur 4. Time-lapse bilder av axon-inducerad GLT1 promotor aktivering i MCP med BAC GLT1 EGFP astrocyter och vilda nervceller typ. Dynamiska förändringar av EGFP intensitet och tillväxten av axoner samlades in genom en 6d INTERVALLINSPELNING efter astrocyt plätering. (A) 24h (B) 48h (C) 68H (D) 92H (E) 112h (F) 140h. Inmatning av enXons (markeras med gula pilar) in i astrocyt sidan observerades från 48 timmar till 92h, som korrelerar med ökad EGFP fluorescensintensitet. Minskning av EGFP fluorescensintensitet inträffade från 112H till 140H efter kainit (200 pM) applicerades på den neuronala sidan vid 92h att inducera neuronal celldöd och axon degeneration. Skala bar: 50 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCP baserade neuron och astrocyter samodlingssystemet tillåter dissektion av detaljerade neuron till astroglia signalvägar genom att endast axoner passerar de centrala kanalerna och interagera med astrogliaceller. Denna samodlingssystemet kan enkelt ställa upp med konventionell neuron och astrocyt förfaranden kultur. Vi beskrev också en praktisk tillämpning av denna samodlingssystemet genom att använda en EGFP baserad reporter för att visa axon-beroende aktivering GLT1 promotor i astrocyter.
Denna MCP baserade neuron och astroglia samodlingssystemet erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella sam-odlingsmetoder: 1) förmåga att visualisera och identifiera explicita morfologiska samspelet mellan enskilda axoner och astrocyter i realtid under hög upplösning mikroskopi 2) en väl -styrd oberoende mikromiljön att tillämpa farmakologisk manipulation för cellspecifik effekt 3) analys av promotor aktiveringoch proteinuttryck inducerades uteslutande / uppregleras i astrocyter som moduleras av axoner kontakt. Som kultur förfarandena för primär mikroglia 10 och oligodendrocyter 11 har väl etablerade, kan denna MCP samodlingssystemet också tillämpas på neuron till mikroglia och neuron till oligodendrocyt samkulturer. Samtidigt inser vi också att denna samodlingssystemet är avsedd för känsliga bildanalys vid den enda cellnivå, som är komplementär till de konventionella metoder för analys av stora mängder av celler, såsom RNA eller proteinanalys. Dessutom förenklar vårt system den enorma interaktionen mellan neuroner och gliaceller in vivo genom exemplifierande samverkan mellan en enda cell och axon. Alla dessa bör beaktas vid tolkning av resultaten från denna samodlingssystemet. I CNS, interaktionen mellan axoner och olika gliaceller är allmänt närvarande och är kritiskt viktiga för både neuron ochgliala funktioner 12,13. Utvecklingen av denna samodlingssystemet gör avbildning baserad dissektion av dessa interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Jeffrey Rothstein för att ge BAC GLT1 EGFP möss och GLT1 antikropp, Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) för att tillhandahålla värdefulla core faciliteter, ny fakultet rekrytering bidrag (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) i Tufts neurovetenskap Institutionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
| Neuron culture medium for plating cell
|
|||
| Astrocyte culture medium
|
|||
| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
|||
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S.
