Summary
本研究介绍了一种新的神经元轴突和神经胶质细胞共培养（ASTRO）平台的程序。在此共培养体系中的一个单一的轴突（及单一的神经胶质细胞）之间的直接相互作用，操纵变得可行，允许机械分析的相互神经胶质信令。
Abstract
适当的神经元，神经胶质细胞相互作用的中枢神经系统（CNS）的生理功能是至关重要的。这种双向通信老练介导的神经元和神经胶质细胞1,2之间通过特定的信号转导通路。这些信号通路的识别和表征如何神经元的神经胶质细胞相互作用的形状中枢神经系统生理学的理解是必不可少的。在此之前，神经元和神经胶质细胞混合培养已被广泛用于测试和表征神经元和神经胶质细胞之间的信号传导通路。我们已经从这些制剂及其他体内的工具，但是，已经表明，神经元和神经胶质细胞相互之间的信号往往发生在特定的车厢内神经元（ 即轴突，树突或胞体）3。这使得重要的是要开发一种新的文化系统，让神经车厢分离，专门研究神经胶质细胞和神经之间的相互作用NAL轴突/树突。此外，以往的混合培养系统是不能够分化的可溶性因子和神经元和神经胶质细胞之间的直接膜接触信号。此外，大量的神经元和神经胶质细胞，在传统的共培养体系缺乏必要的分辨率，观察到一个单一的轴突和神经胶质细胞之间的相互作用。
在这项研究中，我们描述了一种新的轴突和神经胶质细胞共培养系统与使用平台（MCP）的微流体文化。在此共同培养系统中，神经元和神经胶质细胞培养在两个单独的腔室，通过连接多个中央通道。在这个微文化平台，神经元的过程（特别是轴突）可以通过中央通道进入的胶质。结合强大的荧光蛋白标记，该系统可以直接检查/树突状轴突和胶质细胞相互作用的信号转导通路之间，这样的小号轴突神经胶质细胞，神经胶质细胞介导的受体贩运神经元的终端，和神经胶质细胞介导的轴突生长介导的转录调控。的窄直径的腔室，也显着到胶质室禁止神经元的富集培养基的流，促进轴突/树突和胶质表面之间的直接膜 - 蛋白质相互作用的探测。
Protocol
1。大会的微流控文化厅（MCP）
- MCP（ 图1）是开放的腔室隔间培养不同类型的单元4设计。它典型地具有被连接的两个隔室，通过中央通道（直径为3微米）。大会MCP玻璃底的菜肴是必须的为编制文化和后续的图像分析。
- 首先，外套的无菌玻璃有底菜肴用多聚鸟氨酸（Sigma-Aldrich公司，1毫克/毫升）溶解在四硼酸钠（Sigma-Aldrich公司，10mM的pH为8.5）中，并在37℃下孵育过夜
- 翌日，镀膜玻璃有底菜肴与DDH 2 O洗涤三次，并干燥无菌通风柜下。然后玻璃底船菜肴进一步涂覆与层粘连蛋白（Sigma-Aldrich公司，1毫克/毫升），并在UV光下干燥1小时。涂层菜已经准备好使用，也可以使用储存在-20°C至。这些涂重新所需的电镀神经元和神经胶质细胞的共培养。
- 为了组装的文化平台，微流体文化平台被放置在顶部的涂覆的玻璃底菜肴与中央连接通道，在其底侧，形成一个紧密的密封。正常神经元或星形胶质细胞的培养基中加入（从细胞电镀区域）的两侧（ 图1）上到组装的MCP和在37℃下温育2-4小时，以确保有没有MCP和玻璃之间的泄漏底菜。我们已经测试了镀槽前的介质，以确保没有泄漏。组装MCP上的玻璃底的菜应新鲜配制，使用前。
2。神经细胞的培养和诱导的神经元轴突在组装MCP的制备
- 从胚胎14-16日龄小鼠的大脑皮质神经元细胞培养新鲜烹制的。神经元的培养基中，2％B27 neurobasa neurobasal培养基组成升补充，通过添加1％的100倍GlutaMAX，和1％青霉素 - 链霉素，2mM谷氨酰胺。小鼠大脑的解剖，在解剖显微镜下，从皮质脑膜。然后将组织剁碎用剃刀片，以增加的表面积暴露于胰蛋白酶，使小的组织块。胰酶消化组织块（Sigma-Aldrich公司0.05％胰蛋白酶），在37℃水浴10分钟，然后解离用火抛光的巴斯德吸管轻轻研磨。通过70微米的过滤器过滤，收集游离细胞明显的神经元细胞悬液。
- 镀组装MCP的右侧（ 图1）上的细胞上的镀部分的神经元（2-3×10 6个 /毫升，150微升），使神经元可以附加在单元格中的保留区（ 图1）。新鲜制备的神经元与神经元电镀介质中，其中补充了5％牛胎儿血清（Hyclone）到稳压铺板ŕ神经元的培养基。因为只有附着在细胞保持区域的神经元，能够生长的轴突成通过中央通道的另一侧的组装MCP，板高密度的神经元细胞中电镀面积是重要的，以确保足够的神经元连接到细胞保留区。是在图2A中所示的神经元的轴突的高密度的一位代表图像。
- 翌日，神经元的镀介质代替由经常的神经元的培养基。改变培养基，通过仔细地吸镀细胞的介质从腔室的面积，但不是从组装MCP细胞保留区，以避免在单元格中的保留区和中央连接通道的气泡。气泡会严重抑制轴突生长和后来进入中央通道在MCP。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，10〜20纳克/毫升）的另一侧（左侧）上也被加入在同一天的腔室，从组装MCP（ 图2A）通过中央通道的神经元的侧视图和横促进轴突生长5诱导。相当不GDNF的情况下，也观察到自发的神经轴突生长的神经元侧和交叉通过中央通道的组装MCP。通常可观察到轴突进入中央通道电镀后的2-3天。轴突一旦进入中央通道，它们通常在一天之内的另一侧输入。轴突通常是完整的至少一个星期后，进入另一侧。
3。增加，建立条块分割的共培养系统培养的星形胶质细胞MCP
主要P1-3鼠标小狗大脑星形胶质细胞培养制备。脑分离程序是类似上述的神经元细胞的分离过程。星形胶质细胞，接种于10 cm培养皿中预涂用多聚鸟氨酸（Sigma-Aldrich公司，1毫克/毫升）。星形胶质细胞培养基（DMEM，10％胎牛血清，1％青霉素，链霉素），未来两天每天更换，以清除污物。在那之后，将培养基改变每三天。
- 星形胶质细胞成为90％汇合形成单层后7天。汇合的星形胶质细胞用胰蛋白酶消化和再悬浮的星形胶质细胞（1×10 6个 / ml）的150微升的重新组装MCP左侧进入细胞电镀面积镀覆时轴突即将进入或刚才订立的左侧组装的MCP。星形胶质细胞，通常接种后4-5天的神经元镀。的GDNF首先被除去之前，星形胶质细胞的再镀到左侧的MCP。附着在细胞中保留区再镀敷的星形胶质细胞，GFAP的免疫染色（ 图1）所示。只有很少的两侧腔室之间流动的介质（通过荧光ð确定是）被发现在MCP，如前所示4,6。
- 星形胶质细胞成为90％汇合形成单层后7天。汇合的星形胶质细胞用胰蛋白酶消化和150微升的重新悬浮的星形胶质细胞（1×10 6个 / ml）被重新组装MCP左侧进入细胞电镀面积镀覆时轴突即将进入或刚订立左侧侧的组装MCP。星形胶质细胞，通常接种后4-5天的神经元镀。的GDNF首先被除去之前，星形胶质细胞的再镀到左侧的MCP。附着在细胞中保留区再镀敷的星形胶质细胞，GFAP的免疫染色（ 图1）所示。介质腔室的两侧之间只有最小流速（由荧光染料确定）被发现在MCP，如前所示4,6。
- 后重新电镀的星形胶质细胞，轴突进入组装MCP左侧直接与ASTR交互ocytes通过直接的轴突接触或释放可溶性因子。免疫组织化学染色进行可视化的星形胶质细胞的质膜谷氨酸转运GLT1βIII-微管蛋白和神经元的轴突和星形胶质细胞之间的相互作用，如在图2D-F所示。
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Representative Results
轴突诱导GLT1的启动子活性在星形胶质细胞延时成像分析
隔间的神经元和星形胶质细胞的共培养系统允许的神经元的过程，尤其是在轴突，以选择性地与星形胶质细胞相互作用。不同类型的轴突神经胶质细胞相互作用的成功建立在组装MCP的轴突和星形胶质细胞（或其他神经胶质细胞）共培养后，可以研究，如轴突诱导活化的星形胶质细胞的基因启动子活性，星形胶质细胞诱导的轴突导向轴突诱导星形胶质细胞的Ca 2 +的反应，和轴突诱导的髓鞘少突胶质细胞合成。所有这些应用中利用强大的荧光记者的可用性可加载到这些细胞的神经胶质细胞或染料。
在这里，我们描述轴突诱导的转录激活的星形胶质细胞谷氨酸转运（GLT1）启动用细菌人工染色体一些（BAC）的GLT1的eGFP转基因小鼠和这条块的共培养系统。在BAC GLT1的eGFP转基因小鼠，eGFP荧光记者的GLT1基因组启动子7的控制下过表达。表达的绿色荧光蛋白记者与内源性GLT1启动子活性蛋白的表达和功能活性，从 而使评估GLT1单星形胶质细胞原位启动子的活性。星形胶质细胞GLT1表达是高度依赖于神经刺激6,8。原代星形细胞表达最低水平为GLT1;然而，GLT1表达水平（mRNA和蛋白）与神经元的9是共同培养的星形胶质细胞中强烈诱导。这里示出显着增加GLT1条块共培养系统中（ 图3）的免疫反应的证据。在传统的神经元和星形胶质细胞共培养，高密度的神经元，使不太理想的观察GLT1启动子的转录激活神经元轴突的影响。
要监视的应用程序后，组装MCP的左侧的GDNF的轴突依赖GLT1的启动子活化，诱导野生型神经元培养在组装的MCP和轴突的右侧。在左侧组装MCP培养的星形胶质细胞来自BAC GLT1的eGFP小鼠的轴突后已被诱导和刚进入组装MCP左侧。总共有6天（24小时，140小时）时间推移图像采集监控的绿色荧光蛋白的荧光强度变化的实时性和轴突生长的MCP。如在图4A中所示，非常最小eGFP荧光在星形胶质细胞中的表达，观察24小时后的电镀的星形胶质细胞。共培养48小时后，观察eGFP的强度显着增加（从24小时至68小时）时，轴突侧成星形胶质细胞和互动直接接触的星形胶质细胞（ 图4 BC）。另一方面，eGFP荧光强度逐渐下降，一旦轴突缩回和退化卡因酸（200μM）诱导组装MCP（ 图4D-F）的 （右）侧上的神经元的神经元细胞死亡。响应于轴突eGFP荧光强度的动态变化，清楚地表明，星形胶质细胞GLT1启动子的活性是由轴突交互调制。
图1。示意图的的微流体神经元和星形胶质细胞共培养平台。微流控文化平台（MCP）有两个车厢连接的中央通道。细胞可以从细胞电镀面积镀在每边和保留区，并通过从细胞诱导神经轴突通过中央渠道耳鼻喉科呃的另一侧（插入的比例尺为50μm）。
图2。 （A） 诱导的MCP MCP与星形胶质细胞的轴突的神经元轴突和互动。高密度的组装MCP在细胞内保留区的神经元，发现的βIII-微管蛋白的免疫组化。比例尺：50μm的（B）的放大视图的轴突交叉的中央通道，并输入到另一侧的MCP。比例尺：100μm的（C）的轴突生长锥BIII-微管蛋白染色揭示的轴突进入时的另一侧的MCP。比例尺：100μm的（D）的生长的轴突束通过的中央通道，并进入另一侧的MCP。 （E）星形胶质细胞中的胶质的MCP所揭示的GLT1免疫。 （F）合并后的图像显示轴突和GLT1阳性星形胶质细胞之间的接触。比例尺：50微米。
图3。依赖于神经元的诱导GLT1在星形胶质细胞中的表达。GLT1免疫反应性（A）（B）主星形胶质细胞培养，比例尺：50微米的主要培养的神经元，和（C）原代神经元和星形胶质细胞共培养。比例尺：神经元的免疫组化染色βIII-微管蛋白。显著增长的GLT1免疫反应中观察到神经元和星形胶质细胞共培养。
图4。收集后，经过6天时间的推移记录星形胶质细胞电镀时间的推移图像 eGFP的强度和轴突生长的轴突诱导GLT1启动子活性，MCP与BAC GLT1绿色荧光蛋白星形胶质细胞和野生型神经元的动态变化。 （A）24小时（B）48小时（C）68H（D）92H（E）112H（F）140H。输入一个观察从48小时到92H增加eGFP荧光强度与xons（所强调的黄色箭头）星形胶质细胞的。卡因酸（200μM）涂布于神经元的侧在92H诱导神经细胞死亡和轴突变性后发生从112H到140H的eGFP荧光强度减少。比例尺：50微米。
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Discussion
MCP基于神经元和星形胶质细胞共培养体系可以详细的神经元，星形胶质细胞信号转导通路的解剖允许唯一的轴突通过中央通道，并与星形胶质细胞。此共培养体系可以方便地设置与传统的神经元，星形胶质细胞的培养程序。我们也采用的绿色荧光蛋白记者展示轴突取决于GLT1的启动子活性在星形胶质细胞共培养系统的实际应用。
这种MCP基于神经元和星形胶质细胞共培养体系提供良好的相比，传统的培养方法的几个优点：1）能力，可视化，并确定明确的形态之间的相互作用单一的轴突和神经胶质细胞的实时高分辨率显微镜下2）控制的独立微环境申请药理操纵特定小区效果3）的启动子活化分析专门诱导蛋白表达在星形胶质细胞的轴突接触，调制/上调。作为培养10初级小胶质细胞和少突胶质细胞11的程序已经确立，这MCP共培养系统也可以施加到神经元的小胶质细胞和神经元的少突胶质细胞的共培养物。同时，我们还认识到，这是共培养系统的目的是在单细胞水平，这是互补的分析大量的细胞，如RNA或蛋白质分析的常规方法为敏感的图像分析。此外，我们的系统简化了巨大的例证之间的相互作用在体内的单细胞轴突的神经元和神经胶质细胞之间的相互作用。所有这些解释结果时，应考虑从这种合作培养体系。在中枢神经系统轴突和神经胶质细胞之间的相互作用是广泛存在的，并且是非常重要的两个神经元，胶质细胞的功能12,13。这种合作文化系统的发展将使这些相互作用为基础的解剖成像。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢Jeffrey罗斯坦提供BAC GLT1的绿色荧光蛋白的小鼠和GLT1抗体; Tufts中心神经科学研究所（NIH P30 NS047243 PI，罗布·杰克逊）提供有价值的核心设备，招聘新教师津贴（NIH P30 5P30NS069254-02 PI，菲尔·海登）在塔夫茨大学神经科学系。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D Systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
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| Neuron culture medium for plating cell
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| Astrocyte culture medium
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| Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
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References
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