Summary
アフリカツメガエルの卵抽出物は、DNA損傷チェックポイントを調査するために有用なモデル系である。このプロトコルは、 アフリカツメガエルの卵抽出物とDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製のためのものです。これらの技術は、DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の研究ではDNA損傷の様々なアプローチに適応可能である。
Abstract
毎日のように、細胞は内因性と環境の様々な侮辱にさらされる。これらの侮辱に対抗するために、細胞はDNA損傷に対するDNA損傷と直接的な細胞応答を検知する監視機構としてシグナリングDNA損傷チェックポイントを進化させてきた。 DNA損傷チェックポイントシグナル（ 図1）に関わるセンサ、トランスデューサとエフェクターと呼ばれるタンパク質のいくつかのグループがあります。この複雑なシグナル伝達経路では、ATR（ATMとRAD3関連）がDNA損傷と複製ストレスに応答することができる主要なキナーゼの一つである。活性化されたATRは、そのようなのChk1（チェックポイントキナーゼ1）のような、その下流の基質をリン酸化することができます。その結果、リン酸化され、活性化されChk1は、細胞周期の停止、転写活性化、DNA損傷修復、アポトーシスや老化（ 図1）を含むDNA損傷チェックポイントには多くの下 流効果につながる。 DNAが損傷されると、unrepでDNA損傷チェックポイントの結果を有効にするには失敗放映された被害と、その後、ゲノム不安定性。 DNA損傷チェックポイントの研究では、細胞は、ゲノムの完全性を維持する方法を解明し、癌などの方法ヒト疾患のより良い理解を提供し、開発していきます。
アフリカツメガエル卵抽出液は、DNA損傷チェックポイントの研究に強力な無細胞抽出液をモデル系として浮上している。低速抽出（LSE）は、当初、増井グループ1によって記述されていた。 DNAは細胞周期ごとに必ず一度、半保存方法で複製されている核形成のLSEの結果にdemembranated精子クロマチンの追加。
ATR/Chk1-mediatedチェックポイントシグナル伝達経路はDNA損傷や複製ストレス2によってトリガされます。 DNA損傷のアプローチとDNA損傷を模倣構造3：2つの方法は、現在、DNA損傷チェックポイントを誘導するために使用されています。 DNA損傷は、紫外線（UV）照射、γ線照射、メチルメタンによって誘導することができるesulfonate（MMS）、マイトマイシンC（MMC）、4 -ニトロキノリン-1 -オキシド（4-NQO）、またはアフィジコリン3、4。 MMSはDNA複製を阻害し、ATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントの活性化4-7アルキル化剤である。 UV照射もATR/Chk1-dependent DNA損傷チェックポイント8をトリガします 。 DNA損傷模倣構造AT70は、2つのオリゴヌクレオチド、ポリ - （DA）70とポリ（dT）を70のアニールされた複合体である。 AT70システムはビルダンフィーの研究室で開発したと9月12日 、広くATR/Chk1チェックポイントシグナル伝達を誘導するために使用されています。
ここでは、（2）DNA損傷模倣構造を準備するために2つの異なるDNA損傷のアプローチ（MMSとUV）、（3）でアフリカツメガエルの精子クロマチンを治療するために、無細胞卵抽出（LSE）を準備するためのプロトコルは、（1）について説明AT70、（4）損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷を模倣する構造を持つLSEでATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントをトリガします。
Protocol
1。 LSEの準備
- 雌のカエル（ アフリカツメガエル ） は採卵のために二度注射する。最初の注入（プライミング）は、カエルあたり100 U PMSG（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）です。カエルは、少なくとも2日間卵を敷設し、下塗りしたカエルを誘導する前に下塗りしなければならない最大2週間のために使用可能である。素数カエルに、3 mlのシリンジと27Gの針を用いて背部リンパ嚢の皮下にPMSG注射する。
- 産卵を誘発するために、27Gの針を用いて背側リンパ嚢の皮下にプライミングカエル当たり500 UのhCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を注入。 1Xマルクの改変リンゲル液（MMR）の2リットルを含む別々のバケツに注入されたカエルをインキュベートする。カエルのコレクションの前に卵を産むために14から20時間を許可します。
- バケツからカエルを取り出して、約100ミリリットルを退場するまでのMMRソリューションをオフに注ぐ。 250mlビーカーに卵を転送することによって、バケットから卵を入手してください。
- 2％システインの100ミリリットル（調整を加えることによってDejellyの卵10 MのKOHでpHを7.8〜）。倒立ガラスパスツールピペット（直径0.7センチメートル）は約30秒ごとと静かに回して卵を。インキュベーション中にデカントし、二回新鮮なシステインと交換してください。卵はビーカーの底でより凝縮層を形成するときdejellyingプロセスは、約5〜15分で完了します。
- システイン溶液を捨て、0.25x、MMRで卵を3回洗浄する。ガラスピペットによる溶液中の卵を渦巻。 "Bad"の卵は簡単な目視検査によって決定され、外観は白の "真綿"がされています。 "悪い"卵が渦巻く後にビーカーの中心に蓄積されます。パスツールピペットにより "悪い"卵を削除します。
- 卵の溶解緩衝液（ELB）で3回卵を洗います。パスツールピペットにより、任意の付加的な "悪い"卵を削除します。 14ミリリットルのファルコンチューブに卵を入れて。
- 卵をコンパクトにし、スウィングローターでCL2 IEC臨床卓上型遠心機を用いて188×gで（1,100 rpm）で55秒間ファルコンチューブを回転させます。から過剰なバッファを削除卵層の上部。アプロチニン/ロイペプチン株式及び圧密卵のmlあたりサイトカラシンBの株式の0.5μlの0.5μlを添加する。
- ℃のHB6スウィングローターのソーバルRC6プラス超高速遠心機を用いて4℃で15分間16500 x g（10,000 rpm）以上で卵を遠心分離します。遠心分離後、卵がチューブ内の3層に分画されています：それぞれ脂質、エキス、卵黄/上から下への顔料、。穿刺21Gの針で真ん中抽出層の下部のファルコンチューブの側面。穿刺針はプラスチックを妨げることがあるので慎重に針を外します。抽出液を集めるために穿刺部位に1mlシリンジに取り付けられた新鮮な21Gの針を挿入します。ゆっくり脂質と卵黄/顔料層と気泡や汚染を避けるために、シリンジに抽出液を吸引除去する。
- 冷やした1.5 mlのマイクロチューブに抽出物を置きます。卵抽出物の各ミリリットルの場合は、内に次のような化学原液を追加dicated最終濃度（括弧内）：（1）10μlのシクロヘキシミド（100μg/ ml）を、（2）を1μlアプロチニン/ロイペプチン（10μg/ mlの各々）、（3）1μlのサイトカラシンB（5μg/ mlの）、（4）1μlのジチオスレイトール（1mM）を、（5）0.33μlのノコダゾール（3μg/ ml）を。卵は優しく少なくとも10倍を抽出反転。これは新鮮な作られ、4時間以内に使用しなければならないLSEです。 LSEの品質は4時間または凍結融解後に侵害された。
2。 DNA損傷アプローチと精子クロマチンの治療
- 以前13に記載の方法に従って、通常の精子クロマチンを準備します。
- MMSの処理精子クロマチンを調製
- 0.5ミリリットルバッファXに正常な精子クロマチンを再懸濁し
- 100 mMの最終濃度にクロマチンを再懸濁し500μlにMMSの〜5.5μL（株式の9.1 M）を追加します。
- 回転しながら30分間、室温で遠心管中の精子クロマチンをインキュベートする。
- メートルを紡ぐスウィングローターとチューブ·アダプター付きIEC CL2臨床遠心分離機を用いて室温で10分間、686×gで（2,100 rpm）でicrocentrifugeチューブ。
- 上清を捨て、バッファXプラスBSA（3％）、DTT（0.1 mM）およびアプロチニン/ロイペプチン（10μg/ mlの各）0.5 mlにペレットを再懸濁します。
- 手順（4）を繰り返し、（5）倍精子クロマチンを洗浄する。
- 血球計数器で精子クロマチンの濃度を決定し、10万精子/μlに希釈します。さらに使用するために-80℃の冷凍庫に5μlのアリコートを保存します。
- 紫外線処理した精子クロマチンを調製
- パラフィルムの片の表面に正常な精子クロマチンの所望の量（ 例えば、10μl）を追加します。
- 紫外線架橋剤にパラフィルムを置きます。あなたの実験に応じて、所望のエネルギーパラメータを設定し、UV光を介して精子クロマチンを傷つけ始める。例えば、それは、1,000 J / mの2に到達するのに約21秒かかります。
- 紫外線IRRA後にdiation、紫外線処理した精子クロマチンはすぐに卵抽出物に加えられるべきです。
3。 DNA損傷模倣構造の作製（AT70）
- それぞれ2μg/μLの濃度に水で70（T70と称する）ポリ（dT）を70（DA） - ポリ（A70と称する）と2つの合成オリゴヌクレオチドを溶かす。
- 1 1.5 mlのマイクロチューブに100μlのA70とT70の100μlを添加する。 heatblockで95°Cで5分のための混合合成オリゴ溶液を沸騰。
- 乾燥浴ブロックを取り出す（その中に混合AT入ったチューブ付き）、それは実験台の上に室温まで冷却させます。この温度調整は約45から60分かかります。
- 冷却された混合物は2μg/μlの最終濃度はAT70です。さらに使用するために-20℃の冷凍庫でAT70アリコートのストアを10μl。
4。損傷した精子クロマチンやDNA損傷とLSEにおけるDNA損傷チェックポイントをトリガ模倣構造
- 損傷した精子クロマチンとLSEにおけるDNA損傷チェックポイントを誘導
- 1.5 mlのマイクロチューブにLSEの50μlを添加し、エネルギー混合液1μlおよび損傷精子クロマチン（最終濃度4000〜精子/μl反応系）を2μlとそれを補完するものです。
- 90分間室温で反応管をインキュベートし、10分ごとにチューブをフリック。
- 30分間インキュベートした後、核色素溶液1μlを補った顕微鏡スライド上に、反応混合物を1μlを分注する。反応混合物の上にカバースリップを置き、蛍光顕微鏡を介して、核形成を確認してください。典型的には、円形の核は、DNA複製が開始したことを示す、インキュベーションの30分後に形成されます。
- サンプルバッファー90μlのに反応混合物10μlを取る。試料は抗Chk1のP-S344または抗Chk1の抗体を用いたイムノブロットによって分析されています。
- とLSEにおけるDNA損傷チェックポイントを誘導AT70
- エネルギー混合物の1μlとTautomycin株式の1.6μlで補わ1.5 mlのマイクロチューブにLSEの50μlを添加する。
- 各反応に既製AT70（2μg/μLの場合）または水（陰性対照として）1.25μlを添加する。 90分間室温で反応をインキュベートする。反応チューブを10分毎にフリックします。
- サンプルバッファー90μlのに反応混合物の10μlを追加します。試料は抗Chk1のP-S344または抗Chk1の抗体を用いた免疫を介して検査されます。
5。代表的な結果
損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷を模倣する構造はアフリカツメガエル卵抽出系におけるATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントをトリガすることができます。 図2Aは MMSがの指標である、Ser344（CHK1 P-S344）でChk1のリン酸化を誘導することを示していますATRキナーゼの活性化。 図2Bに示すDNA損傷模倣STRUとしてそのAT70、影も、Chk1のリン酸化をトリガします。合計Chk1のサンプルは両方の例でコントロールを読み込むとして使用されています。
図1。 DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の図。
図2。 Chk1のリン酸化は、 アフリカツメガエルの卵抽出物中のMMSかAT70の治療のいずれかによって引き起こされる。（）、MMS、損傷の精子クロマチン（MMS）、または通常の精子クロマチン（CON）を90分間卵抽出液中でインキュベートされる。 Chk1のSer344のリン酸化（CHK1 P-S344）と卵抽出物中の総Chk1のは、免疫ブロット法を介して検査されます。 （B）はAT70または水（CON）は、それぞれ、卵抽出液中に添加されています。サンプルはまた、（）のようにして免疫ブロッティングによって分析されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
アフリカツメガエルの卵抽出液を用いたDNA損傷チェックポイントを研究する際にはいくつかの利点があります。卵抽出物の使用は、細胞周期の間期で同期無細胞抽出液を大量に提供しています。卵抽出物を容易かつ安価に行うことができます。これは、DNAやクロマチンを損傷すると卵抽出液から目的タンパク質をimmunodepleting後のDNA損傷チェックポイントの欠陥を明らかにすることは比較的容易である。続いて、ポテンシャル関数の欠陥は、野生型または変異型組換えタンパク質のaddbackによって "救出"することができます。したがって、 アフリカツメガエルの卵抽出物はDNA損傷チェックポイントの構造と機能解析のための強力なモデル系である。
LSEの準備はすでに14を示したが 、我々のプロトコルはいくつかの変更をもっています。 hCG注射（18℃）の後、カエルをインキュベートの温度は産卵のために非常に重要です。カエルを処理し、注入するより多くのリソースを見つけることができる以前の研究から13,14などのようなインターネット上のtropicalis.berkeley.edu /ホーム/ obtaining_embryos / hCG.html / HCG 。一般的には、LSEの1-3 mlの1カエル由来卵から調製することができる。それはLSEを準備するのに約1時間かかり、それが周りに4時間の氷の上で一般的に安定しています。 LSEはそれはDNA損傷チェックポイントの実験で使うためにLSEの品質を凍結し、妥協を解凍ので必要なときに新鮮な作らなければならない。ステップ1.9では、私たちは、原液を作って冷凍庫にアリコートを保存し、それぞれの化学物質のために分注し凍結ストックを使用することをお勧めします。我々の経験では、これらのアリコートは、最大3回の凍結融解サイクルのために使用可能である。
そのようなMMSなどのDNA損傷の試薬 が（ 図2A参照）Chk1のリン酸化を誘発するためLSEで調べられている。 DNA損傷試薬は、ロンドン証券取引所に直接添加するか、SPを損傷するために使用することができLSEに添加する前に、ERMのクロマチン。 DNA損傷の試薬の濃度は、最も可能性の高いChk1のリン酸化をトリガするために最高の条件を得るためには、特定の実験のために最適化する必要があります。紫外線照射もChk1のリン酸化（データは図示せず）を介して損傷精子クロマチンおよびDNA損傷チェックポイントの研究の活性化に活用することができる。 アフリカツメガエルにおけるChk1のリン酸化部位のSer344は人間8におけるChk1のSer345と類似して保存されたサイトです。
合成オリゴAT70混合物は、DNA損傷の構造を模倣しています。 Tautomycin（ホスファターゼ阻害剤）の存在下で、AT70誘起Chk1のリン酸化は安定しており、（ 図2（b）に示すように）免疫ブロット法を調べることができます。合計内因性のChk1、ローディングコントロールとして使用されます。 AT70はChk1のがリン酸化されたことを示す、ウェスタンブロット上で可視化することができる合計のChk1における移動度シフトをトリガーします。 Chk1のリン酸化に対する抗体と総Chk1はアフリカツメガエルにおけるDNA損傷チェックポイントシグナル伝達の解析をイムノブロットに適しています。
全体的には、 アフリカツメガエルの卵抽出システムは、DNA損傷チェックポイントを調査するための強力な無細胞モデル系である。このプロトコルは、そのような分析のための詳細な手順について説明します。このシステムは、様々なDNA損傷の様々なアプローチを使用して、DNA損傷チェックポイントの分子メカニズムを研究するために変調することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ノースカロライナ大学シャーロット校、教員の卓越性のためのワコビア基礎基金、NIGMS（R15GM101571）からの助成金によって提供された資金によって部分的にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml H–chst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. | ||
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
