アフリカツメガエルの卵抽出物は、DNA損傷チェックポイントを調査するために有用なモデル系である。このプロトコルは、 アフリカツメガエルの卵抽出物とDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製のためのものです。これらの技術は、DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の研究ではDNA損傷の様々なアプローチに適応可能である。
毎日のように、細胞は内因性と環境の様々な侮辱にさらされる。これらの侮辱に対抗するために、細胞はDNA損傷に対するDNA損傷と直接的な細胞応答を検知する監視機構としてシグナリングDNA損傷チェックポイントを進化させてきた。 DNA損傷チェックポイントシグナル( 図1)に関わるセンサ、トランスデューサとエフェクターと呼ばれるタンパク質のいくつかのグループがあります。この複雑なシグナル伝達経路では、ATR(ATMとRAD3関連)がDNA損傷と複製ストレスに応答することができる主要なキナーゼの一つである。活性化されたATRは、そのようなのChk1(チェックポイントキナーゼ1)のような、その下流の基質をリン酸化することができます。その結果、リン酸化され、活性化されChk1は、細胞周期の停止、転写活性化、DNA損傷修復、アポトーシスや老化( 図1)を含むDNA損傷チェックポイントには多くの下 流効果につながる。 DNAが損傷されると、unrepでDNA損傷チェックポイントの結果を有効にするには失敗放映された被害と、その後、ゲノム不安定性。 DNA損傷チェックポイントの研究では、細胞は、ゲノムの完全性を維持する方法を解明し、癌などの方法ヒト疾患のより良い理解を提供し、開発していきます。
アフリカツメガエル卵抽出液は、DNA損傷チェックポイントの研究に強力な無細胞抽出液をモデル系として浮上している。低速抽出(LSE)は、当初、増井グループ1によって記述されていた。 DNAは細胞周期ごとに必ず一度、半保存方法で複製されている核形成のLSEの結果にdemembranated精子クロマチンの追加。
ATR/Chk1-mediatedチェックポイントシグナル伝達経路はDNA損傷や複製ストレス2によってトリガされます。 DNA損傷のアプローチとDNA損傷を模倣構造3:2つの方法は、現在、DNA損傷チェックポイントを誘導するために使用されています。 DNA損傷は、紫外線(UV)照射、γ線照射、メチルメタンによって誘導することができるesulfonate(MMS)、マイトマイシンC(MMC)、4 -ニトロキノリン-1 -オキシド(4-NQO)、またはアフィジコリン3、4。 MMSはDNA複製を阻害し、ATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントの活性化4-7アルキル化剤である。 UV照射もATR/Chk1-dependent DNA損傷チェックポイント8をトリガします 。 DNA損傷模倣構造AT70は、2つのオリゴヌクレオチド、ポリ – (DA)70とポリ(dT)を70のアニールされた複合体である。 AT70システムはビルダンフィーの研究室で開発したと9月12日 、広くATR/Chk1チェックポイントシグナル伝達を誘導するために使用されています。
ここでは、(2)DNA損傷模倣構造を準備するために2つの異なるDNA損傷のアプローチ(MMSとUV)、(3)でアフリカツメガエルの精子クロマチンを治療するために、無細胞卵抽出(LSE)を準備するためのプロトコルは、(1)について説明AT70、(4)損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷を模倣する構造を持つLSEでATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントをトリガします。
アフリカツメガエルの卵抽出液を用いたDNA損傷チェックポイントを研究する際にはいくつかの利点があります。卵抽出物の使用は、細胞周期の間期で同期無細胞抽出液を大量に提供しています。卵抽出物を容易かつ安価に行うことができます。これは、DNAやクロマチンを損傷すると卵抽出液から目的タンパク質をimmunodepleting後のDNA損傷チェックポイントの欠陥を明らかにすることは比…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ノースカロライナ大学シャーロット校、教員の卓越性のためのワコビア基礎基金、NIGMS(R15GM101571)からの助成金によって提供された資金によって部分的にサポートされています。
Reagents | |||
Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
hCG | Sigma | CG10-10VL | |
L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Sample buffer | Sigma | S3401 | |
Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
Equipment | |||
Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
Solutions | |||
1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |