Xenopus æggeekstrakt er et nyttigt model-system til at undersøge DNA beskadigelse checkpoint'et. Denne protokol er til fremstilling af Xenopus æg ekstrakter og DNA beskadigelse checkpoint'et inducerende reagenser. Disse teknikker kan tilpasses til en række DNA-ødelæggende fremgangsmåder i undersøgelsen af DNA beskadigelse checkpoint'et signalering.
På daglig basis, er celler underkastes en række forskellige endogene og miljømæssige fornærmelser. For at bekæmpe disse fornærmelser er celler udviklet DNA beskadigelse checkpoint signalering som en overvågningsmekanisme til at fornemme DNA-skader og direkte cellulære reaktioner på DNA-skader. Der er flere grupper af proteiner kaldet sensorer, transducere og effektorer er involveret i DNA beskadigelse checkpoint'et signalering (fig. 1). I denne komplekse signalvejen, er ATR (ATM og Rad3-relateret) en af de store kinaser der kan reagere på DNA-beskadigelse og replikation stress. Aktiveret ATR kan phosphorylere dens downstream substrater såsom Chk1 (Checkpoint kinase 1). Følgelig phosphoryleret og aktiveret Chk1 fører til mange downstream effekter i DNA beskadigelse checkpoint'et herunder cellecyklusstandsning, transkriptionsaktivering, DNA-beskadigelse reparation, og apoptose eller fremadskridende alderdom (figur 1). Når DNA er beskadiget, ikke at aktivere DNA beskadigelse checkpoint'et resulterer i unrepluftet skade og efterfølgende genomisk ustabilitet. Undersøgelsen af DNA skade checkpoint vil belyse, hvordan cellerne opretholder genomisk integritet og give en bedre forståelse af, hvordan humane sygdomme, såsom kræft, udvikle sig.
Xenopus laevis æg ekstrakter dukker op som en kraftfuld cellefri ekstrakt modelsystem i DNA beskadigelse checkpoint'et forskning. Lav hastighed ekstrakt (LSE) blev oprindeligt beskrevet af Masui gruppe 1. Tilsætningen af demembranated sperm chromatin til LSE resulterer i kerner dannelse hvor DNA replikeres i en semi måde gang pr cellecyklus.
Den ATR/Chk1-mediated checkpoint signalvejen udløses af DNA-beskadigelse eller replikation stress 2. To metoder anvendes for tiden til at inducere DNA beskadigelse checkpoint: DNA-ødelæggende metoder og DNA-skader der efterligner strukturer 3. DNA-beskadigelse kan induceres af ultraviolet (UV) bestråling, γ-bestråling, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinolin-1-oxid (4-NQO), eller aphidicolin 3, 4. MMS er et alkyleringsmiddel, der inhiberer DNA-replikation og aktiverer ATR/Chk1-mediated DNA beskadigelse checkpoint'et 4-7. UV-bestråling også udløser ATR/Chk1-dependent DNA-skader checkpoint 8. Den DNA-beskadigelse-efterlignende struktur AT70 er et udglødet kompleks af to oligonucleotider poly-(dA) 70 og poly-(dT) 70. Det AT70-systemet blev udviklet i Bill Dunphy laboratorium og er almindeligt anvendt til at fremkalde ATR/Chk1 checkpoint signalering 9-12.
Her beskriver vi protokoller (1) til fremstilling af cellefrie ekstrakter æg (LSE), (2) at behandle Xenopus spermakromatin med to forskellige DNA-ødelæggende fremgangsmåder (MMS og UV), (3) til fremstilling af DNA-beskadigelse-efterlignende struktur AT70, og (4) at udløse ATR/Chk1-mediated DNA beskadigelse checkpoint'et i LSE med beskadiget spermakromatin eller en DNA-beskadigelse-efterlignende struktur.
Der er flere fordele ved at studere DNA beskadigelse checkpoint ved hjælp af Xenopus æg ekstrakter. Anvendelsen af æg ekstrakter giver en stor mængde cellefri ekstrakter synkroniseret ved interfasen af cellecyklussen. Ægget ekstrakter kan let og billigt fremstillet. Det er relativt let at beskadige DNA eller kromatin og at afsløre en fejl i DNA beskadigelse checkpoint'et efter immunodepleting et målprotein fra æggeekstrakt. Efterfølgende kan en potentiel funktion defekt blive "redd…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er delvist understøttet af midler fra The University of North Carolina i Charlotte, Wachovia fundament fond til fakultet ekspertise, og et tilskud fra NIGMS (R15GM101571).
Reagents | |||
Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
hCG | Sigma | CG10-10VL | |
L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Sample buffer | Sigma | S3401 | |
Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
Equipment | |||
Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
Solutions | |||
1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |