Summary
optogenetics의 개발은 이제 정확하게 유전자 정의 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 방법을 모두 제공합니다
Abstract
neuronal 연결의 Elucidating 패턴은 임상과 기초 모두 신경 과학에 대한 도전이었다. 전기 생리학은 시냅스 연결의 패턴을 분석 황금 표준 왔지만 짝 electrophysiological 레코딩 성가신와 실험적으로 제한을 모두 할 수 있습니다. optogenetics의 발달은 체외 1과 생체 2,3에서 모두 뉴런과 회로를 자극 할 수있는 우아한 방법을 도입하였습니다. 이산 neuronal 인구에 옵신 표현을 유도 세포 유형의 특정 발기인의 활동을 이용하여, 하나는 정확하게 구별 회로 4-6에서 유전자 정의 neuronal 하위 유형을 자극 할 수 있습니다. 전기 자극 및 / 또는 약리 조작 등의 뉴런을, 자극에 잘 설명 방법은 종종 침입 세포 유형의 무차별이고, 주변 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 이러한 제한은 전형적인 시냅스 기능 및 / 또는 회로의 동작을 변경 수 있습니다. 또한, 인해조작의 성격에, 현재의 방법은 종종 급성 및 단말 있습니다. Optogenetics는 비교적 무해한 방식으로 뉴런을 자극하고, 유전자 타겟으로 뉴런에 할 수있는 능력을 갖게. 생체 optogenetics에 관한 연구의 대부분은 현재 주입 캐뉼라 6,7를 거치게 광학 섬유를 사용하지만,이 방법의 한계는 광섬유의 반복 삽입과 손상된 뇌 조직과 캐뉼라 내부의 섬유의 잠재적 인 파손이 포함되어 있습니다. optogenetics의 급성장 분야 감안할 때, 만성 자극의 더 신뢰할 수있는 방법은 최소한의 부수적 인 조직 손상과 장기 연구를 촉진 할 필요가 있습니다. 여기 효과적이고 우아 스파르타 외에 설명 된 방법을 보완하기 위해 비디오 기사 등의 수정 프로토콜을 제공합니다. 8 anesthetized 마우스의 두개골로 광섬유 이식 및 영구 고정의 제조뿐만 아니라의 조립에 섬유광 커플러는 광원에 임플란트를 연결. 고체 레이저를 광섬유로 연결 임플란트는 만성 적은 조직 손상 9 작은 분리, tethers을 사용하여 기능 neuronal 회로를 photostimulate 할 수있는 효율적인 방법을 할 수 있습니다. 광섬유 임플란트를 영구적으로 고정을 제공 일관 최소한의 조직 손상을 갖춘 10 개 깨어 행동 쥐 neuronal 회로의 생체 optogenetic 연구의 장기.
Protocol
각 제조업체 및 / 또는 공급 업체와 함께 * 모든 자료는 프로토콜 아래에 나열되어 있습니다.
1. 임플란트의 조립
- 수지의 1g에 경화제의 100 밀리그램을 추가하여 열 경화 광섬유 에폭시의 혼합물을 준비한다.
- 측정 및 쐐기 팁 초경 서기로 골의 100 μm 코어와 광 125 μm 섬유의 약 35mm를 잘라. 단일 방향 운동에서 광 섬유 및 점수에 서기 수직를 배치합니다. 섬유를 절단하는 것은 완전히 섬유 코어가 손상됩니다.
- 부회장에 구멍 127 μm로 물미 LC 세라믹을 삽입, 볼록면은 아래 지적했다.
- 페럴에 광 섬유를 삽입합니다. 광 섬유 부드럽게 밀어과 영특 페럴 (그림 1a)의 볼록 넘어 돌출한다.
- 에폭시는 검은 색 변까지 열 총을 평면 엔드와 열에 열 경화 광섬유 에폭시 한 방울을 적용합니다. 에폭시는해야이 가열 및 이전 치료 될 때 페럴을 입력합니다. 에폭시는 일정한 열 응용 프로그램의 ~ 1 분 이내에 치료해야합니다.
- 이 커플러와 인터페이스를 방해하므로, 페럴의 측면을 따라 모든 에폭시를 제거합니다.
- 연마 패드의 알루미늄 산화물 연마 시트 (그림 1b)에 LC 광섬유 연마 디스크 (FOPD)를 사용 페럴의 볼록 끝을 폴란드어. 원형 회전 패턴을 확인하고 다음과 같은 순서로 네 개의 등급에 폴란드어 : 5, 3, 1 0.3 μm의 모래.
- 가 관심 지역을 대상으로하는 등의 적절한 길이로 평면 끝 부분에 광 섬유를 잘라. 길이는 stereotaxic지도 책을 사용하여 결정될 수있다.
- 아래에 설명 된 커플러 코드를 통해 레이저에 연결하여 임플란트를 테스트합니다. 임플란트의 광택 끝은 커플러의 슬리브에 삽입되고 반대 페럴과 연락해야합니다. 임플란트는 일의 끝에서 측정, 광 출력의 10 MW를 유지 할 수 있어야한다전자 주입 섬유. 나쁜 임플란트는 광 섬유의 끝 근처에 약한 초점을 갖게됩니다.
- 사용까지 폼의 완성 이식을 (그림 1C) 저장합니다.
2. 광섬유 커플러 코드의 조립
- 위와 같이 열 경화 광섬유 에폭시의 혼합물을 준비한다.
- 측정 및 쐐기 팁 초경 서기로 점수를하여 200 μm 코어와 광 220 μm 섬유의 적절한 길이를 잘라. 섬유의 길이는 마우스가 주택 주변에 자유롭게 이동할 수 있지만, 마우스가 섬유를 통해 씹을 할 수 없습니다.
- 광섬유 길이보다 약간 긴 분기 관의 길이에 광 섬유를 삽입합니다. 튜브는 광 섬유보다 약간 큰 내부 직경이 있어야합니다.
- 스트립 ~ 25mm 광학 섬유의 한쪽 끝에서와 멀티 FC의 MM의 금속 끝에 삽입은 멈출 때까지 230 μm는 지루한 회의를 페럴. 광 섬유 ferru을 통해 내밀다한다르 엔드 (그림 2A).
- 금속 끝에서 (슈퍼 접착제) 시아 노 아세틸렌과의 연결을 고정합니다. 커넥터 부팅과의 연결을 커버하고 FC FOPD와 페럴 끝을 폴란드어. 5, 3, 1, 0.3 μm 그릿 (그림 2B) : 원형 회전 패턴 및 다음과 같은 순서로 네 개의 등급에 폴란드어를 확인합니다.
- 말초 볼록 끝과 LC 세라믹 페럴 (230 μm ID 구멍)에 광 섬유의 다른 쪽 끝을 샅샅이 삽입합니다. 치유 될 때까지 평면 엔드와 열에 에폭시 한 방울을 적용합니다.
- 위에서 설명한대로 알루미늄 산화물 연마 시트에 FC FOPD를 사용 페럴의 볼록 끝을 폴란드어.
- 슬리브의 중간 지점까지 페럴의 볼록 끝으로 LC 페럴 슬리브를 슬라이드.
- 장소 열 수축 분기 관과 연결합니다 (그림 2C)를 확보하고 보호하는 슬리브와 열을 통해 튜브를.
- 레이저 소스에 연결하고 빛 outp를 측정하여 커플러을 테스트분광 광도계와 커플러를 통해 UT. 레이저 출력과 측정 된 커플러 출력 사이의 빛 손실이 30 %를 초과 할 수 없습니다.
3. 외과 이식
*이 팁 전용 절차입니다. 장비는 살균이지만 장갑 악기 및 장비 사이의 지속적인 조작으로 인해 할 필요가 없습니다.
- intraperitoneal 주사 케타민 / Xylazine 혼합 100 30 게이지 바늘을 사용하여 각각 10 밀리그램 / kg으로 마우스를 마취.
- 가위로 두피를 면도. Betasept 번 반복, 두 분을 위해 (4 % Chlorhexidine 솔루션) 닦아 다음 70% 이소 프로필 알코올과 두피를 닦아주십시오.
- sterotaxic 장비에 마우스를 놓고 두개골 레벨이되도록 머리를 보호합니다. 건조 및 수술 통증을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용합니다. 산소가 MOU의 생리적 상태에 따라 희석 volatized isoflurane (1-3 %를 사용 마취를 유지계속 꼬리 핀치에 대응하여 모니터링해야 SE).
- 람다에 눈 궤도에서 두개골을 노출, 두피의 중간 선을 통해 절개를합니다. 필요에 따라 결합 조직을 버리고 밀어 넣습니다.
- 피부를 막아 Serafin 클램프를 사용하여 두개골 (그림 3A)에 대한 액세스를 유지합니다.
- 치과 피크와 두개골의 표면에 걸쳐 엣지 바둑판 무늬로하는 패턴. 멸균 식염수에 떨어진 파편을 씻으십시오. 철저하게 말린다.
- micropores를 만들려면 ~ 2-3 초에 면봉으로 노출 된 두개골에 과산화수소 (3 %)을 적용합니다. 여러 번 씻고 완전히 건조 시키십시오. 스파르타 외에 설명 된대로 또는 앵커는 두개골에 실수 할 수 있습니다. (2012).
- 다시 말하지만, 에칭 바둑판 무늬로하는 치과 곡괭이로 두개골에 걸쳐 패턴과는 식염수에 파편을 씻어. 철저하게 말린다.
- 회전 도구를 사용 멸균 드릴 비트와 함께 작은 버 구멍 craniotomy을 (직경 <1 ㎜) 확인(autoclaved) 위의 bregma와 람다로 조정 stereotaxic지도 책에 의해 결정 관심 지역. 경질을 어기거나 조직을 손상하지 않도록주의하십시오. 쓰레기를 씻어 철저히 건조 시키십시오.
- 프로브 홀더에 광섬유 페럴 (임플란트)을 삽입하고 stereotaxic 팔에 연결합니다.
- 직접 stereotaxic 팔 (그림 3B)를 사용하여 관심 지역 위 자리에 임플란트를 배치합니다. 뇌 조직에 광섬유를 삽입하면 섬유 ~ 2 ㎜ / 분의 속도로 천천히 전진해야합니다. 페럴은 남아있는 두개골에 휴식을해야합니다.
- 치과 시멘트의 혼합물을 준비한다. 혼합물은 쉽게 두개골에 걸쳐 적용 할 수있는 낮은만큼 점도가 있어야합니다. 혼합 2-4 분에 대해서는 사용이 될 것입니다.
- 멸균 이쑤시개 사용하여 두개골에서와 임플란트의 하부로 치과 시멘트의 얇은, 심지어 레이어를 적용합니다. 로 치과 시멘트의 기본 층은 두개골에 많은 면적을 커버해야합니다수. 마우스의 피부와 접촉 치과 시멘트를 짓게하지 마세요. 이 증가 suturing에 어려움뿐만 아니라 마우스에 자극을 야기합니다. 치과 시멘트가 피부에 접촉 않는 경우, 부분적으로 시멘트의 전체 레이어가 설정되기 전에 벗겨 될 수 있도록 건조 할 수 있습니다.
- 완전히 건조하도록 허용합니다.
- 각 층 (그림 3C) 완전히 건조 할 수 있도록 두개골을 극복하고 임플란트 주위로 작은 마운드를 형성하기 위해 치과 시멘트도 층을 적용합니다. 부드러운, 탁 트인 연결을 할 수 있도록 시멘트의 깨끗한 페럴의 볼록 월말 ~ 3~5밀리미터 둡니다.
- 치과 시멘트의 마운드 위에와 C22 바늘로 멸균, 단일 사용 실크 편조 봉합 (6-0)를 사용하여 임플란트 주변의 두피를 봉합 해. 7 일 후 제거합니다. 선택 사항 : suturing 이후 추가 바인딩을 사용 뇌려 본드. 최소한의 뇌려 본드를 사용하십시오. 초과는 긁힘으로 인해 심각한 피부 손상을 초래할 수 있습니다.
- Immediatel수술 후 Y는 마우스 피하에 수술 통증을 줄일 Ketprophen (5 밀리그램 / kg)을 주입해야합니다. 이 24 시간 이상 반복해야합니다. 임플란트의 기초 봉합 피부와 주변 국소 진통제 (Bupivicaine)와 항생제를 (Neosporin) 적용됩니다.
- 마취에서 회복을위한 난방 담요 새장에 마우스를 놓습니다. 멸균, 수술 후 회복 케이지에 마우스를 놓습니다. 복구 케이지 온도를 유지하고 질식을 방지하기 위해 모든 침구를 포함 할 수 없습니다. 마우스는 원래 케이지 또는 한 번 깨어 새로운 케이지에 반환 할 수 있습니다.
광원과 관심 지역의 광 섬유 끝 사이에 최소한의 광자 손실 광섬유 임플란트 및 커플러 결과의 적절한 조립. 잘 연마 광섬유는 단일, 동심 원에게 (그림 2D)에 빛을 전송해야합니다. 주의 주입 및 suturing으로 임플란트가에 눈에 띄는 자극을 발생하지 않습니다마우스와 광 섬유 또는 전송 빛의 양의 큰 저하없이 장기 연구 (그림 3D,> 1 달되지 않은 관찰)에 장소에 남아있을 수 있습니다. 부적절한 주입 또는 suturing는 자극을 일으킬 수 있으며, 영구적 인해 조작에 치과 시멘트, 또는 치과 시멘트에서 페럴의 파손 노출의 두피를 긁는 마우스 될 수 있습니다. 조립 시스템의 개략도는 그림 4에서 볼 수 있습니다.
그림 1. implantable 광섬유 조립. (A) 광섬유는 영특 화살촉으로 표시 볼록 넘어 돌출, 페럴에 삽입됩니다. (b)는 페럴의 볼록 끝을 연마 시트 점차적으로 미세한 성적에 FOPD를 사용하여 연마하고 있습니다. (C) 마감 implantable 섬유 선택집적 회로. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 보형물로 테 더링 광섬유 로터리 조인트를하는 데 광섬유 커플러 조립. 페럴 어셈블리를 통해 (가) 광섬유 꽂 혔지. (b)는 어셈블리의 페럴 측면은 광택 용지를 사용하여 FOPD과 광택이 점진적으로 세밀한 등급으로 삽입됩니다. (C) 페럴 슬리브는 페럴 위에 장착 및 열 수축 튜브로 고정된다. (D) 완료 광섬유 커플러는 최소 광자 손실이있는 동심 빛을 생산해야합니다.
그림 3. 외과 주입 섬유 광학. craniu의 (A)는 표면 전체m이 노출되어 있으며 결합 조직이 지워집니다. (B) 광섬유 보형물은 stereotaxic 팔 위치에 개최됩니다. (C) 치과 시멘트는 두개골에 광섬유 임플란트를 수정 적용됩니다. (D) 주입 후> 1 월 피부는 임플란트 주변에 치유하고 염증의 흔적이 없습니다.
그림 4. 기능 시스템의 개략도
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Discussion
Optogenetics 특정 neuronal 하위 유형 통해 전례없는 제어를 할 수있는 강력하고 새로운 기술입니다. 전극을 통해 셀 타입 무차별 및 전기 자극의 침해 효과를 피하는 동안이는 해부학과 측두엽 정밀도와 신경 회로를 조절하기 위해 악용 할 수 있습니다. 섬유 광학의 주입은 조직에 최소한의 손상과 쥐 행동, 깨어에서 여러 세션을 통해 신경 회로의 일관성, 만성 자극 할 수 있습니다. 이 시스템은 원래 스파르타 외에 의해 개척. 8 우리의 목적에 맞게 수정이 주입 된 캐뉼라보다 한 단계에 들어갔 및 장기 연구에서 세션 사이에 타겟팅 일관성을 보장하기 위해 관심 영역의 위치에 광 섬유를 해결할 수 있습니다. 임플란트는 뇌의 다른 영역을 자극하도록 구성 할 수 있습니다.
이 방법에서 다양한 단계 세부에 정밀도와 관심이 필요합니다. 광섬유 커플 링의 각 교차점입니다반드시 최소한의 빛 손실을 보장하기 위해 연마. 연마 후, 끝은 섬유 코어는 전혀 손상이없는 것을 확인하기 위해 현미경으로 검사해야합니다. 소스와 측정 된 출력 사이의 빛 손실이 30 %를 초과하는 경우, 각 부분은 최대 광자 플럭스 또는 부분 폐기해야합니다 수 있으며 remade하는 repolished해야합니다. 페럴은 슬리브에 밀어하지 않는 경우, 페럴을 방해 슬리브 내부의 가능성이 파편이 있습니다. 부착과 보형물에 커플러 코드를 제거 할 때 힘이 임플란트의 축에 직접 병렬로 적용해야합니다. 많이 포유류의 조직 모으지 빛과 푸른 빛의 상대적으로 낮은 에너지, 보형물은 섬유의 끝은 관심 지역 500 μm 이내의 거리에 있습니다 있도록 위치해야한다는 사실로 인해 어디에서 초기 광 전력 밀도> 10 % 6 지속. 이 cran에 임플란트를 해결이 레이어이므로 주입하는 동안, 치과 시멘트의 기본 층은 중요한 단계입니다ium. 이후 레이어는베이스 층에 보형물을 확보 및 보호를 제공합니다. 두개골이 완전히 건조되지 않은 경우 기본 층은 잘 준수하지 않습니다, 모든 섹션이 잘 준수하지 않은 경우,이 마우스 조작이 전체 임플란트를 제거 할 수도 있습니다. 또는 치과 시멘트에 대한 앵커는 더 안전한 고정물의 두개골에 실수 할 수 있습니다.
행동 연구에서, 외부 빛의 누설은 마우스에 의도하지 않은 신호를 제공 할 수 있습니다. 외부 빛의 누수가 직접 마우스를 통해 임플란트 및 커플러 코드 사이의 연결에서 발생 가능성이 가장 높은 것입니다. 빛 누수를 최소화하기 위해 열 수축 튜브는 더 완전히 누설에 대한 차폐 추가를 제공하기 위해 페럴 슬리브 포함되도록 확장 할 수 있습니다. 이 옵션을 추구하는 경우, 열 수축 튜브는 ferrules 및 연락처 사이의 직접 접촉에 대한 시각적 피드백을 제공 소매에 창을 충당 할 수는 촉각 요금을 결정해야dback.
이러한 기술의 발전 무렵, 그것은 같은 스파르타 외 8에 설명 추가 stereotaxic 팔을 사용하여 한 번의 마우스에 여러 광섬유 이식 할 수 있습니다. 이 시간적으로 특정 방식으로 또는 다른 지역의 동시 자극에 같은 지역에서 차동 파장 자극을 통해 더 복잡한 연구를 활성화합니다. 또한, 섬유 광학은 지역 자극 및 녹음을위한 생체 전기 생리학에 대한 전극 (optrode)와 커플 링 될 수있다.
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Acknowledgments
이 기술은 원래 스파르타 외., 2012 년까지 설명한 쉽게 우리가 실험실에서 사용하기 위해 적응 된 것을 인정하고 싶다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
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- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
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