Summary
Udviklingen af optogenetics tilvejebringer nu midlerne til præcist stimulere genetisk definerede neuroner og kredsløb, både
Abstract
Afdækning mønstre af neuronal tilslutning har været en udfordring for både kliniske og basal neurovidenskab. Elektrofysiologi har været den gyldne standard til analyse mønstre af synaptisk konnektivitet, men parret elektrofysiologiske optagelser kan være både besværligt og eksperimentelt begrænsende. Udviklingen af optogenetics har indført en elegant fremgangsmåde til at stimulere neuroner og kredsløb, både in vitro 1 og in vivo 2,3. Ved at udnytte celletypespecifik promotor-aktivitet til at drive opsin ekspression i diskrete neuronale populationer, kan man præcist stimulere genetisk definerede neuronale undertyper i adskilte kredsløb 4-6. Godt beskrevne fremgangsmåder til stimulering af neuroner, herunder elektrisk stimulering og / eller farmakologiske manipulationer, er ofte celletype vilkårlig, invasiv og kan beskadige omgivende væv. Disse begrænsninger kan ændre normal synaptisk funktion og / eller kredsløb adfærd. Som følgeaf arten af manipuleringen, er de nuværende metoder ofte akut og terminal. Optogenetics giver evnen til at stimulere neuroner i et relativt uskadelige måde og i genetisk målrettede neuroner. De fleste undersøgelser med in vivo optogenetics øjeblikket anvender en optisk fiber ført gennem en implanteret kanyle 6,7, men begrænsninger ved denne fremgangsmåde indbefatter beskadiget hjernevæv med gentagen indføring af en optisk fiber, og potentielle brud på fiberen inde i kanylen. I betragtning af den blomstrende området optogenetics, er en mere pålidelig metode til kronisk stimulering nødvendig for at lette langtidsundersøgelser med minimal sikkerhed vævsskader. Her giver vi vores modificeret protokol som en video artiklen til at supplere metoden effektivt og elegant beskrevet i Sparta et al. 8 til fremstilling af en fiberoptisk implantat og dens permanent fiksering på kraniet af bedøvede mus, samt montering af fiberoptisk kobler forbinder implantatet til en lyskilde. Implantatet, forbundet med optiske fibre til en solid-state laser, muliggør en effektiv fremgangsmåde til kronisk photostimulate funktionelle neuronal kredsløb med mindre vævsbeskadigelse 9 under anvendelse af små, aftagelige, bindsler. Permanent fiksering af de fiberoptiske implantater giver konsekvent og langsigtet in vivo optogenetic undersøgelser af neuronale kredsløb i vågen, opfører mus 10 med minimal vævsskade.
Protocol
* Alle materialer sammen med de respektive producenter og / eller leverandører er angivet nedenfor protokollen.
1. Montering af Implantat
- Der fremstilles en blanding af varmehærdelig fiberoptisk epoxy ved tilsætning af 100 mg af hærder til 1 g harpiks.
- Mål og skære omkring 35 mm på 125 um fiberoptiske med 100 um kerne ved at score det med en kile-tip hårdmetal skriver. Placer skriftlærde vinkelret på fiberoptiske og score i en enkelt, ensrettet bevægelse. Skæring fiberen helt vil skade fiberkernen.
- Indsæt en LC keramisk rørring med en 127 um boring ind i skruestik, konveks side pegede nedad.
- Sæt fiberoptiske ind i rørringen. Den fiberoptiske bør glide jævnt og marginalt rager ud over konveks ende af rørringen (figur 1a).
- Påfør en dråbe varmehærdelige fiberoptiske epoxy til den flade ende og varme med varmepistol indtil epoxy bliver sort. The epoxy børfylde rørringen, når den opvarmes og før hærdning. Den epoxy bør hærde inden ~ 1 min af konstant varme ansøgning.
- Fjern eventuelt epoxy langs siderne af rørringen, da den hindrer grænseflader til kobleren.
- Polere den konvekse ende af rørringen under anvendelse af en LC fiberoptisk polerskive (FOPD) på aluminiumoxid polering ark på polerpad (figur 1b). Gør cirkulære rotation mønstre og polere på fire kvaliteter i følgende rækkefølge: 5, 3, 1 0,3 um grus.
- Skær fiberoptiske ved den flade ende til den passende længde, således at den er rettet mod området af interesse. Længden kan bestemmes ved hjælp af stereotaktisk atlas.
- Test implantatet ved at tilslutte den til laseren via kobleren ledning beskrevet nedenfor. Den polerede ende af implantatet er indsat i muffen af kobleren og bør komme i direkte kontakt med den modstående rørring. Implantatet skal være i stand til at opretholde 10 mW af virkningsgrad, målt ved spidsen af the implantat fiber. En dårlig implantat vil have en svag knudepunkt nær spidsen af den fiberoptiske.
- Opbevar de færdige implantater (figur 1c) i skum indtil brug.
2. Montering af Fiber Optic Coupler Cord
- Der fremstilles en blanding af varmehærdelig fiberoptisk epoxy som ovenfor.
- Mål og skær en passende længde på 220 um fiber optik med 200 um kerne ved at score det med en kile-tip hårdmetal skriver. Længden af fiberen bør tillade musen for at bevæge sig frit i huset, men ikke tillade musen at tygge gennem fiberen.
- Sæt fiberoptiske i en længde af furkaturerne slange lidt længere end den fiberoptiske længde. Røret skal have en indre diameter lidt større end den fiberoptiske.
- Strip ~ 25mm i den ene ende af den fiberoptiske og sæt den ind i metal ende af en Multimode FC MM bøsningsenheden med 230 um bar indtil det stopper. Den fiberoptiske skal stikke ud gennem ferrule ende (figur 2a).
- Sikre forbindelsen med cyanoacrylat (superlim) ved metal ende. Dæk forbindelse med en Connector Boot og polere ferrule ende med en FC FOPD. Gør cirkulære rotation mønstre og polere på fire kvaliteter i følgende rækkefølge: 5, 3, 1, 0,3 um grus (figur 2b).
- Bånd og den anden ende af den fiberoptiske ind i en LC keramikring (230 um id boring) med den konvekse ende distale. Påfør en dråbe epoxy til den flade ende og varme, indtil helbredt.
- Polere den konvekse ende af rørringen under anvendelse af en FC FOPD på aluminiumoxid polering plader som beskrevet ovenfor.
- Skub a LC rørring bøsning over den konvekse ende af rørringen til midtpunktet af muffen.
- Sted varmekrymperør over furkaturerne rør og muffen og varme for at sikre og beskytte forbindelsen (figur 2c).
- Test koblingen ved at tilslutte den til laserkilde og måling af lysudbytteut gennem kobleren med et spektrofotometer. Lyset tab mellem laser output og den målte kobling output bør ikke overstige 30%.
3. Kirurgisk implantation
* Dette er et tip kun procedure. Instrumenterne er sterile, men handsker behøver ikke at skyldes konstant manipulation mellem instrumenter og udstyr.
- Bedøve mus med en intraperitoneal injektion ketamin / xylazin blanding 100 og 10 mg / kg under anvendelse af en 30-gauge nål.
- Shave hovedbunden med neglesaks. Tør hovedbunden med 70% isopropylalkohol efterfulgt af Betasept tørres (4% Chlorhexidin opløsning) i to minutter, gentaget én gang.
- Placer musen i sterotaxic rig og sikre hovedet, sikrer, at kraniet er i vater. Påfør oftalmisk salve til øjnene for at forhindre tørhed og postoperative smerter. Bevar anæstesi ved hjælp forflygtigede isofluran (1-3% fortyndet med ilt afhængig fysiologiske tilstand mouse, som bør overvåges kontinuerligt af svar på en hale knivspids).
- Lave et snit gennem midterlinien i hovedbunden, udsætter kraniet fra øjet kredsløb for at lambda. Skubbe bindevæv efter behov.
- Brug Serafin klemmer til at holde tilbage i huden og opretholde en adgang til baghovedet (figur 3a).
- Etch et ternet mønster i hele overfladen af kraniet med dental pick. Vask debris væk med sterilt saltvand. Tør grundigt.
- Anvend hydrogenperoxid (3%) til den udsatte baghovedet med en vatpind for ~ 2-3 sek at oprette mikroporer. Vask flere gange og tør grundigt. Alternativt kan ankre skrues ind i kraniet, som beskrevet i Sparta et al. (2012).
- Igen etch et ternet mønster i hele kraniet med en dental pick og vaske væk snavs med saltvand. Tør grundigt.
- Anvendelse af en roterende værktøj, et lille borehul kraniotomi (<1 mm i diameter) gøre med en steril borekrone(Autoklaverede) over området af interesse, bestemmes af den stereotaksiske atlas kalibreret til bregma og lambda. Vær omhyggelig med ikke at bryde dura eller beskadige nogen væv. Vask væk vragrester og tør grundigt.
- Sæt det fiberoptiske rørring (implantat) i probeholderen og tilslut til stereotaktisk arm.
- Placere implantatet på plads direkte over området af interesse ved hjælp af stereotaktisk arm (figur 3b). Hvis indsætte den optiske fiber i hjernevævet, bør fiberen fremføres langsomt med en hastighed på ~ 2 mm / min. Rørringen skal hvile på den resterende baghovedet.
- Klargør en blanding af dental cement. Blandingen bør have en tilstrækkelig lav viskositet til let anvendes i hele kraniet. Blandingen vil være anvendelige til 2-4 min.
- Anvendelse af en steril tandstikker, et tyndt, jævnt lag af dentalcement anvendes i hele kraniet og på den nedre del af implantatet. Basislaget af dentalcement bør dække så meget overfladeareal på kraniet sommuligt. Lad ikke dentalcement kommer i kontakt med huden af mus. Dette vil føre til forøget vanskelighed ved suturering samt irritation af musen. Hvis dentalcement kommer i kontakt med huden, lad det tørre delvist, således at hele lag cement kan skrælles før indstillingen.
- Lad det tørre helt.
- Påfør selv lag af dental cement til at danne en lille forhøjning over kraniet og omkring implantatet, så hvert lag tørre helt (figur 3c). Forlade ~ 3-5 mm af den konvekse ende af rørringen ren af cement for at sikre en problemfri, uhindret forbindelse.
- Sy hovedbunden over bunke af dental cement og omkring implantatet ved hjælp af sterile, engangsbrug silke flettede suturer (6-0) med en C22 nål. Fjern efter 7 dage. Valgfrit: Brug Vet Bond for yderligere binding efter suturering. Vær sikker på at bruge minimal Vet Bond. Overskydende kan føre til alvorlige hudskader på grund af ridser.
- Immediately efter kirurgi, bør mus blive injiceret subkutant med Ketprophen (5 mg / kg) til at reducere postoperative smerter. Dette gentages 24 timer senere. Anvende topiske analgetika (bupivicain) og antibiotika (Neosporin) til den syede huden og rundt om basis af implantatet.
- Placer musen i et bur over et varmetæppe til nyttiggørelse fra anæstesi. Den placeres i en steril, postoperative recovery bur. Det opsving bur bør ikke indeholde nogen strøelse for at opretholde temperaturen og undgå kvælning. Musen kan returneres til den oprindelige bur eller et nyt bur gang vågen.
Korrekt samling af den fiberoptiske implantat og kobling resulterer i minimal foton tab mellem lyskilden og enden af den fiberoptiske i området af interesse. Well-polerede fiberoptik skal transmittere lys i en uniform, koncentrisk cirkel (figur 2d). Med omhyggelig implantation og suturering, bevirker implantatet ingen synlig irritationmusen og kan forblive på plads i langtidsundersøgelser (figur 3D,> 1 måned, upublicerede observationer) uden nogen væsentlig forringelse af den fiberoptiske eller mængden af transmitteret lys. Forkert implantation eller suturering kan forårsage irritation og kan resultere i mus skrabe gennem hovedbunden, eksponering af dentalcement, eller brud af rørringen fra dentalcement grund af vedvarende manipulation. Et skematisk diagram over det samlede system kan ses i figur 4.
Figur 1. Montering af implanterbare fiberoptik. (A) Den fiberoptiske indføres i rørringen, marginalt rager ud over den konvekse ende indikeret ved pilehovedet. (B) Den konvekse ende af rørringen er poleret ved anvendelse af en FOPD på progressivt finere kvaliteter af polering ark. (C) Det færdige implantable fiber optic. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Samling af fiberoptisk kobler anvendes til forankring den fiberoptiske roterende led til implantatet. (A) Fiberoptisk klæbning gennem bøsningsenheden. (B) Den ferrule side af samlingen er indsat i de FOPD og poleret ved hjælp af gradvist finere kvaliteter af polering papir. (C) ferul muffe er monteret over rørringen og fastgøres med varmekrymperør. (D) Det færdige fiberoptisk kobler bør producere en koncentrisk lys med minimal foton tab.
Figur 3. Kirurgisk implantation af fiberoptik. (A) hele overfladen af cranium er eksponeret og bindevæv er ryddet. (B) Den fiberoptiske implantatet holdes på plads ved stereotaktisk arm. (C) dentalcement påføres fastsættelse af det fiberoptiske implantat med baghovedet. (D)> 1 måned efter implantation, er huden helet omkring implantatet og der er ingen tegn på irritation.
Fig. 4. Skematisk diagram af funktionssystem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetics er en kraftfuld ny teknik, der gør det muligt for hidtil uset kontrol over specifikke neuronale undertyper. Dette kan udnyttes til at modulere neurale kredsløb med anatomiske og temporale nøjagtighed, samtidig med at den celletype-vilkårlige og invasive effekter af elektrisk stimulation ved en elektrode. Implantation af fiber optik gør det muligt for konsekvent og kronisk stimulering af neurale kredsløb over flere sessioner i vågen, opfører mus med minimal skade på væv. Dette system, som oprindeligt udviklet af Sparta et al. 8 og modificeret til at passe vores formål, går et skridt videre end den implanterede kanyle og fikserer fiberoptiske på plads i området af interesse for at sikre ensartet målretning mellem sessioner i langtidsstudier. Implantaterne kan tilpasses til at stimulere forskellige områder af hjernen.
Forskellige trin i denne metode kræver præcision og sans for detaljer. Hver sammenføjning af fiberoptiske kobling ernødvendigvis poleret for at sikre minimal lystab. Efter polering, bør enderne undersøges under et mikroskop for at kontrollere, at der ikke er nogen beskadigelse af fiberkernen. Hvis lystab mellem kilden og den målte produktion overstiger 30%, skal hver del skal repolished at opnå maksimal fotonflux eller den del skal kasseres og remade. Hvis rørringen ikke glider ind i bøsningen, er der sandsynligvis snavs inden i muffen blokerer rørringen. Ved fastgørelse og fjernelse kobleren ledningen til implantatet bør kraft påføres direkte parallel med aksen af implantatet. På grund af den kendsgerning, at pattedyrvæv spreder lys kraftigt og den relativt lave energi af blåt lys, skal implantatet anbragt således, at spidsen af fiberen er inden for 500 um fra området af interesse, hvor> 10% af initial lys effekttæthed fortsætter 6. Under implantation er basislag af dentalcement det kritiske trin, da det er dette lag, der fikserer implantatet til CranIUM. De efterfølgende lag fastgør implantatet til basislaget og yde beskyttelse. Basislaget vil ikke klæbe godt, hvis kraniet ikke er helt tørt, og hvis et afsnit ikke overholdes godt, er det sandsynligt, at manipulation af musen vil løsne hele implantatet. Alternativt kan ankrene for dentalcement skrues ind i kraniet for en mere sikker fikstur.
I adfærdsmæssige undersøgelser, kan ekstern lys lækage give en utilsigtet cue til musen. Eksterne lys lækage er mest sandsynligt ved forbindelsen mellem implantatet og kobler ledningen direkte over mus. For at minimere lysudslip kan varmekrymperør blive yderligere udvidet således, at det fuldstændigt dækker rørringen muffe at tilvejebringe ekstra afskærmning mod lækage. Hvis denne option forfølges, det varmekrymperør dække vinduet i ærmet, der giver visuel feedback for direkte kontakt mellem rørringe og kontakt bør bestemmes med taktil gebyrdback.
Mod yderligere udvikling af denne teknik er det muligt at implantere flere fiberoptik på en enkelt mus via ekstra stereotaksisk våben, som beskrevet i Sparta et al 8. Dette vil muliggøre mere komplekse studier gennem differentiel bølgelængde stimulering i samme region i en tidsmæssigt specifik måde eller samtidig stimulering af forskellige regioner. Derudover kan fiberoptik kobles med elektroder (optrode) til in vivo elektrofysiologi til lokal stimulation og optagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil erkende, at denne teknik oprindeligt blev beskrevet af Sparta et al. 2012 og er let tilpasset til anvendelse i vores laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
