Summary
Развитие optogenetics сейчас предоставляет средства для стимулирования именно генетически определено нейронов и схемы, как
Abstract
Выяснение моделей нейронных соединений был вызов для обеих клинических и фундаментальных нейронаук. Электрофизиология был золотой стандарт для анализа моделей синаптические связи, но в паре электрофизиологических записей может быть как громоздкая и экспериментально ограничения. Развитие optogenetics представила элегантный способ стимулировать нейроны и схем, как в пробирке 1 и в естественных 2,3. Воспользовавшись камерного типа удельной активности промотора ездить опсина выражение в дискретных нейронных популяций, можно стимулировать именно генетически определено нейронов подтипов в различных схем 4-6. Ну описаны методы, чтобы стимулировать нейроны, в том числе электрической стимуляции и / или фармакологических манипуляций, часто камерного типа неизбирательным, инвазивные, и может привести к повреждению окружающих тканей. Эти ограничения могут изменить нормальную синаптическую функцию и / или схемы поведения. Кроме того, благодаряк природе манипуляций, современные методы часто являются острые и терминала. Optogenetics дает возможность стимулировать нейроны в относительно безобидных образом, и в генетически целевых нейронов. Большинство исследований с участием в естественных условиях optogenetics в настоящее время используется оптическое волокно направляется через имплантированные канюли 6,7, однако, ограничения этого метода включают повреждение тканей мозга при повторных вставки оптического волокна, и потенциальные поломки волокна внутри канюли. С учетом растущей области optogenetics, более надежный метод хронической стимуляции необходимо содействовать долгосрочных исследований с минимальным повреждением тканей залога. Здесь мы предлагаем нашим модифицированный протокол в качестве видео-статьи в дополнение к методу эффективно и элегантно описано в Спарте и др. 8. Для изготовления волоконно-оптических имплантата и его постоянной фиксации на черепе анестезированных мышей, а также сборки волокнооптические муфты подключения имплантата к источнику света. Имплантат, связанные с оптическими волокнами твердотельного лазера, позволяет эффективный метод хронически photostimulate функциональных нейронных цепей с меньшим повреждением ткани 9, используя небольшие съемные, ремни. Постоянная фиксация волоконно-оптических имплантатов обеспечивает постоянный, долгосрочный в естественных условиях исследования optogenetic нейронных цепей в проснулась, поведение мышей 10 с минимальным повреждением тканей.
Protocol
* Все материалы вместе с соответствующими производителей и / или поставщиков перечислены ниже протокол.
1. Собрание имплантатов
- Приготовить смесь из тепловым отверждением волоконно-оптических эпоксидных добавлением 100 мг отвердителя на 1 г смолы.
- Отмерьте и отрежьте примерно 35 мм, 125 мкм волоконно-оптический с 100 мкм ядро, забив его с клин наконечник писец карбида. Установите писец перпендикулярно волоконно-оптические и счет в одном, однонаправленное движение. Резка волокна полностью повредить сердцевины волокна.
- Вставьте LC керамической кабельным наконечником, с 127 мкм родила в вице-выпуклой стороной направлен вниз.
- Вставьте волоконно-оптический в наконечник. Волоконно-оптических должна скользить в плавно и незначительно выступают за выпуклым конце наконечника (рис. 1а).
- Нанесите одну каплю тепла отверждаемые волоконно-оптической эпоксидной плоским концом и тепловой энергии, тепловые пушки, пока эпоксидная становится черным. Эпоксидной должнызаполнить наконечником, как она нагревается и до лечения. Эпоксидной должны вылечить в течение ~ 1 мин постоянного применения тепла.
- Очистите от любых эпоксидных по бокам втулки, так как она будет препятствовать взаимодействие с муфтой.
- Польский выпуклые конце наконечника помощью LC волоконно-оптических дисков полировка (FOPD) на оксид алюминия полировки листов на полировальных (рис. 1б). Сделайте круговые вращения модели и отполировать на четыре класса в следующем порядке: 5, 3, 1 0,3 мкм зернистость.
- Вырезать волоконно-оптической на плоский конец в соответствующую длину так, что он нацелен на область интереса. Длина может быть определена с помощью стереотаксической атласе.
- Проверьте имплантата, подключив его к лазерным через соединитель шнура, описанных ниже. Полированный конце имплантат вставляется в рукав муфтой и должны сделать прямой контакт с противоположной наконечником. Имплантат должен быть в состоянии поддерживать 10 мВт светового потока, измеренного на кончике йволоконно электронной имплантата. Плохо имплантат будет иметь слабую координационным центром вблизи вершины волоконно-оптические.
- Хранить готовую имплантатов (рис. 1в) в пену до использования.
2. Собрание Волоконно-оптический кабель Coupler
- Приготовить смесь из тепловым отверждением волоконно-оптических эпоксидных как указано выше.
- Отмерьте и отрежьте необходимую длину 220 мкм волоконно-оптический с 200 мкм ядро, забив его с клин наконечник писец карбида. Длина волокна должна позволить мыши, чтобы свободно передвигаться по корпусу, но не позволяет мыши, чтобы жевать через волокна.
- Вставьте волоконно-оптический в длину развилки трубы чуть больше, чем волоконно-оптической длины. Трубки должны иметь внутренний диаметр немного больше, чем волоконно-оптические.
- Strip ~ 25 мм на одном конце волоконно-оптических и вставить его в металле конце многомодовое MM FC наконечника Ассамблеи с 230 мкм отверстие до упора. Волоконно-оптических должны придерживаться через ferruле конца (рис. 2а).
- Закрепить связи с цианакрилатного (супер клей) на металл конца. Накройте связи с разъема загрузки и полировать наконечником с ФК FOPD. Сделайте круговые вращения и шаблоны для ногтей на четыре класса в следующем порядке: 5, 3, 1, 0,3 мкм зернистость (рис. 2б).
- Зачистите и вставить другой конец волоконно-оптический LC в керамический наконечник (230 мкм ID отверстие) с выпуклой конце дистальной. Нанесите каплю эпоксидной плоским концом и тепла до выздоровления.
- Польский выпуклые конце наконечника помощью FC FOPD на алюминиевых листов оксида полировка, как описано выше.
- Вставьте рукава LC наконечник над выпуклым конца наконечника до середины рукава.
- Место термоусадочные трубки на трубку развилки и втулки и тепла для обеспечения безопасности и защиты соединения (рис. 2).
- Проверка муфты, подключив его к лазерным источником и измерения света OUTPут через муфту с помощью спектрофотометра. Потери света между выходом лазера и измеряли выход ответвителя не должен превышать 30%.
3. Хирургическая имплантация
* Это советы только процедура. Инструменты стерильные перчатки, но не нужно быть связано с постоянным манипуляции между инструментами и оборудованием.
- Anesthetize мыши с внутрибрюшинного введения кетамина / Ксилазин смесь 100 и 10 мг / кг соответственно использованием 30-иглу.
- Бритье головы с ножницами. Протрите кожу головы с 70% изопропиловый спирт следует протирать Betasept (4% раствор хлоргексидина раствора) в течение двух минут, повторяя один раз.
- Поместите мышь в sterotaxic буровой установки и обеспечить головы, гарантируя, что череп уровне. Применение глазной мази для глаз, чтобы предотвратить сухость и послеоперационные боли. Поддержание анестезии с использованием volatized изофлурана (1-3% разбавляют с кислородом в зависимости от физиологического состояния муSE, которая должна быть под постоянным контролем ответ на хвост щепотку).
- Сделайте надрез по средней линии головы, обнажив череп от глаз орбит лямбда. Отодвиньте соединительной ткани по мере необходимости.
- Используйте Серафин зажимы сдержать кожи и поддерживать доступ к черепу (рис. 3а).
- Etch в шахматном порядке по всей поверхности черепа с зубной выбор. Вымойте мусора от стерильным физиологическим раствором. Высохнуть.
- Применение перекиси водорода (3%) к воздействию черепа с помощью ватного тампона на ~ 2-3 сек для создания микропор. Промойте несколько раз и тщательно высушите. Кроме того, якоря могут быть ввинчен в черепе, как описано в Спарте и соавт. (2012).
- Опять же, травления в шахматном порядке по всему черепу с зубной выбор и смыть остатки с физиологическим раствором. Высохнуть.
- С помощью вращающегося инструмента, сделать небольшое отверстие заусенцев трепанация черепа (<1 мм в диаметре) стерильным сверлом(Автоклавного) над областью интересов, определяется стереотаксического атласа калиброванный брегмы и лямбда. Будьте осторожны, чтобы не сломать или повредить оболочку любой ткани. Смойте остатки и тщательно высушите.
- Вставьте волоконно-оптический наконечник (имплантата) в держатель зонда и подключить к стереотаксической руку.
- Установите имплантат на место прямо над областью интересов помощью стереотаксической руки (рис. 3б). Если вставки оптического волокна в ткани головного мозга, волокна должны быть продвигались медленно со скоростью ~ 2 мм / мин. Наконечник должен опираться на оставшихся черепа.
- Приготовить смесь из стоматологического цемента. Смесь должна быть достаточно низкой вязкостью легко применять на черепе. Смесь можно будет использовать в течение 2-4 мин.
- С помощью стерильной зубочистки, нанесите тонкий, ровный слой зубной цемент через череп и на нижнюю часть имплантата. Базовый слой зубной цемент должен охватывать больше площадь поверхности на черепе, каквозможно. Не позволяйте стоматологического цемента вступают в контакт с кожей мыши. Это приведет к увеличению трудности в наложении швов, а также раздражение мыши. Если стоматологического цемента приходят в соприкосновение с кожей, дайте ему высохнуть частично так, что весь слой цемента может быть снята перед установкой.
- Позвольте ему полностью высохнуть.
- Применить даже слоев зубным цементом, чтобы сформировать небольшой курган над черепом и вокруг имплантата, позволяя каждому слою высохнуть (рис. 3в). Оставьте ~ 3-5 мм выпуклой конце наконечник чистой цемента, чтобы обеспечить гладкое, беспрепятственное подключение.
- Шва кожи головы над насыпью зубной цемент и вокруг имплантата с использованием стерильных, одноразовых плетеные шелковые нити (6-0) с C22 иглы. Удалить через 7 дней. Дополнительно: Использование Бонд Vet для дополнительных обязательных после наложения швов. Обязательно используйте минимальное Бонд Vet. Превышение может привести к серьезным повреждениям кожи из-за расчесывания.
- Immediatelу после операции, мышь должна быть подкожно с Ketprophen (5 мг / кг) для уменьшения послеоперационных болей. Это должно быть повторено 24 час позже. Применить актуальные анальгетики (Bupivicaine) и антибиотики (Neosporin) в зашивали кожу и вокруг основания имплантата.
- Наведите в клетке за отопление одеяло для восстановления после анестезии. Наведите в стерильной, послеоперационные клетке восстановления. Восстановление клетке не должно содержать никаких постельных принадлежностей в целях поддержания температуры и избежать удушья. Мышь может быть возвращен в оригинальной клетки или новые клетки один раз проснулся.
Правильный монтаж волоконно-оптических имплантатов и муфты результатов в минимальные потери фотонов между источником света и в конце волоконно-оптической в области интереса. Хорошо полированная волоконной оптики должны пропускать свет в мундире, концентрические окружности (рис. 2, г). При тщательном имплантации и наложения швов, имплантат не вызывает видимого раздражениямышь и может оставаться на месте в течение длительных исследований (рис. 3,> 1 месяца, неопубликованные наблюдения) без существенного ухудшения состояния волоконно-оптических или количество света, пропускаемого. Неправильное имплантации или наложение швов может вызвать раздражение и может привести к царапинам мыши через кожу головы, обнажая зубной цемент, или поломка втулки с зубным цементом из-за постоянных манипуляций. Схема собрана система может быть показано на рисунке 4.
Рисунок 1. Собрания имплантируемых волоконной оптики. (А) волоконно-оптических вставляется в наконечник, незначительно выступающие за пределы выпуклого конце указанном стрелкой. (Б) выпукла конце наконечника полируется использованием FOPD на постепенное тонкие сорта полировки листов. (С) готовой имплантируемых выбирают волокнаIC. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Собрания волоконно-оптический соединитель используется для троса волоконно-оптический поворотный шарнир к имплантата. () Волоконно-оптические прилипание через наконечник сборки. (Б) наконечник стороне сборки вставляют в FOPD и полированной использовании постепенно тонкой полировки сортов бумаги. (С) наконечник гильза устанавливается на наконечник и закрепить термоусадочной трубки. (Г) закончил волоконно-оптические муфты должны производить концентрических свет с минимальными потерями фотонов.
Рисунок 3. Хирургическая имплантация волоконной оптики. (А) всю поверхность craniuм подвергается и соединительной ткани очищается. (Б) волоконно-оптических имплантатов удерживается на месте с стереотаксической руку. (С) Стоматологическая цемента применяется крепления волоконно-оптических имплантата черепа. (D)> 1 месяца после имплантации, кожа зажила вокруг имплантата, и нет никаких признаков раздражения.
Рисунок 4. Принципиальная схема функциональной системы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetics это новая мощная техника, которая позволяет беспрецедентный контроль над конкретным нейронов подтипов. Это может быть использовано для модуляции нейронных цепей с анатомическими и временной точностью, избегая при этом камерного типа неизбирательным и инвазивные эффектов электрической стимуляции через электроды. Имплантация волоконной оптики позволяет последовательно, хронической стимуляции нейронных цепей в течение нескольких сессий в проснулась, поведение мышей с минимальным повреждением тканей. Эта система, первоначально пионером Спарты и др.. 8 и изменены, чтобы соответствовать нашей цели, идет на один шаг дальше имплантировали канюлей и фиксирует волоконно-оптических место в регионе, представляющих интерес для обеспечения последовательной ориентации в период между сессиями в долгосрочных исследованиях. Имплантаты могут быть адаптированы для стимулирования различных регионов мозга.
Различные шаги в рамках этого метода требует точности и внимания к деталям. Каждое соединение волоконно-оптические муфтыобязательно отполированы до минимума потери света. После полировки, концы должны быть рассмотрены под микроскопом, чтобы убедиться, что нет никаких повреждений сердцевины волокна. Если потери света между источником и измеряли выход превышает 30%, каждая часть должна быть repolished для обеспечения максимального потока фотонов или его части должны быть отброшены и переделал. Если наконечник не скользит в рукаве, там, скорее всего мусор внутри гильзы препятствуют наконечником. При установке и удалении соединителя кабеля к имплантат, сила должна быть применена непосредственно параллельно оси имплантата. В связи с тем, что ткани млекопитающих сильно рассеивает свет и относительно низкой энергии синего света, имплантат должен быть расположен таким образом, что кончик волокна находится в пределах 500 мкм интересующей области, где> 10% от начальной плотности мощности света сохраняется 6. Во время имплантации, базовый слой зубной цемент является важным шагом, так как этот слой, который устанавливает имплантат CranНМУ. Последующие слои обеспечить имплантата до базового слоя и обеспечить защиту. Базовый слой не будет придерживаться хорошо, если череп не является полностью сухой, если раздел не придерживался также, вполне вероятно, что манипуляции с мышью выбить весь имплантат. Кроме того, якорей для стоматологического цемента может быть пьяным в череп на более безопасный прибор.
В поведенческих исследований, внешняя утечка света может дать сигнал к непреднамеренным мыши. Внешние утечки света, скорее всего, происходят на связь между имплантатом и соединитель кабеля непосредственно над мышью. Для того, чтобы свести к минимуму утечки света, термоусадочные трубки может быть продлен так, чтобы она полностью покрывала наконечником рукава, чтобы обеспечить дополнительную защиту от утечки. Если эта опция преследовали, термоусадочные трубки будет охватывать окна во втулке, что обеспечивает визуальную обратную связь для прямого контакта между наконечником и контактных должны быть определены с тактильной платыdback.
К дальнейшего развития этой техники, можно насадить несколько волоконной оптики на одной мыши, используя дополнительные стереотаксической руки, как описано в Спарте и др. 8. Это позволит более сложные исследования по дифференциальной длины волны возбуждения в той же области временно определенным образом или одновременной стимуляции различных регионах. Кроме того, волоконная оптика может быть соединен с электродами (optrode) в естественных электрофизиологии для местной стимуляции и записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить, что этот метод был впервые описан Спартой и соавт., 2012 и были легко адаптированы для использования в нашей лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
