Summary
Tatouage de la peau est un moyen puissant et sûr de vaccin à ADN livraison par voie intradermique. Ici, un ADN plasmidique codant pour la EGFP est délivré par le tatouage sur la peau d'une souris de laboratoire, et l'expression de la EGFP dans les cellules de la peau est alors contrôlé par microscopie confocale.
Abstract
Base d'acide nucléique vaccination est un sujet d'intérêt croissant, en particulier l'ADN plasmidique (ADNp) codant pour des antigènes immunologiquement importants. Après la ADNp ingénierie est administré aux vaccins, il est transcrite et traduite en protéines immunogènes qui peuvent provoquer des réactions du système immunitaire. De nombreux moyens de fournir des vaccins à ADN ont été étudiées, mais chaque itinéraire de livraison a ses propres avantages et inconvénients. Tatouage de la peau est une nouvelle technique qui est sûr, rentable et pratique. En outre, les piqûres infligées par l'aiguille pourrait également servir un adjuvant puissant. Ici, on a) démontrer l'administration intradermique de codage ADN plasmidique amélioré la protéine fluorescente verte (pCX-EGFP) dans un modèle de souris à l'aide d'un dispositif de tatouage et b) de confirmer l'expression effective de l'EGFP dans les cellules de la peau en utilisant la microscopie confocale.
Protocol
1. Purification d'ADN plasmidique
- Transformer les cellules eucaryotes plasmide d'ADN codant EGFP (pCX-EGFP) dans des cellules E. coli DH5a compétentes. Le vecteur vide pCX peut également être utilisé comme contrôle négatif.
- Culture et récolte les cellules DH5a de E. coli et de purifier le ADNp selon le Manuel de Qiagen Endofree Purification plasmidique.
- Filtre ADNp solution à travers un filtre de 0,22 um PVDF stérile, et de le stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. Préparation du système de tatouage
- Connectez l'appareil de poche et la pédale de commande à l'unité d'alimentation conformément aux instructions du fabricant.
- Réglez la fréquence d'oscillation aiguille à environ 100 Hz. Pour le dispositif de tatouage, nous avons choisi (système de tatouage Rotary furtif), la molette située sur le bloc d'alimentation doit être réglé à 4 volts. Reportez-vous aux manuels d'utilisation ou de soutien technique pour les systèmes de tatouage d'autres.
- Stériliser l'ar aiguilleray avant de l'utiliser. Nous recommandons d'utiliser un réseau d'aiguilles par animal. Les aiguilles peuvent être réutilisés après avoir été nettoyés à l'eau savonneuse et autoclavés.
- Installer le réseau d'aiguilles dans l'appareil de poche et fixer sans serrer la poignée en plastique.
- Régler la profondeur de l'aiguille sur une valeur adaptée en déplaçant la poignée en plastique vers le haut ou vers le bas. Nous avons utilisé une aiguille profondeur d'environ 0,5 mm pour notre expérience de la souris.
- Serrez la poignée en plastique lorsque la profondeur de l'aiguille est correctement configuré, et le système de tatouage est prêt à l'emploi.
3. Rasage des animaux
- Choisir l'emplacement pour le traitement de tatouage. Le site devrait être une zone relativement solide, plate et charnue de la peau, par exemple, du côté des membres postérieurs de l'animal.
- Anesthésier une souris BALB / c avec un mélange de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) en fonction du poids corporel de l'animal. Pour les autres animaux, reportez-vous aux directives de votre institution d'anesthésie.
- Vérifiez l'réflexes animal de pincer le pied de confirmer l'animal est anesthésié convenablement.
- Utilisez la tondeuse électrique pour couper le cheveu au postérieurs de l'animal lentement et avec précaution. Enlever les poils à partir du site de tatouage prévu et la région environnante.
- Enlever les poils résiduelle plus courte avec le rasoir de sécurité jetable. Veillez à ne pas couper la peau de l'animal. Notez que la crème dépilatoire peut être utilisé comme une alternative épilation méthode, mais nous préférons rasage sur la crème dépilatoire.
- Enlever les poils coupés parasites de la peau avec de l'air comprimé si nécessaire.
4. Livraison d'ADN plasmidique par tatouage
- Si un protocole d'immunisation a été établi précédemment, la dose et le volume de solution d'ADN à appliquer doit être calculé en conséquence. Nous vous recommandons d'utiliser un volume aussi faible que possible afin de rendre le processus plus facile à gérer tatouage. Dans cette démonstration EGFP, nous avons utilisé 7,5 pi de solution d'ADN à un conconcentration de 0,25 mg / ml, qui a été appliquée sur une zone de tatouage d'environ 1 cm 2. Pour les expériences de vaccination, des concentrations plus élevées PDNA peut être nécessaire pour induire une forte réponse immunitaire 1,2.
- Appliquer la solution d'ADN à la pipette directement sur le site de tatouage. En variante, calcul de la solution d'ADN dans la poignée en matière plastique par la pipette, de sorte que le liquide est suspendu entre l'aiguille et la pointe de la poignée en matière plastique. Reportez-vous à la vidéo pour une démonstration. Nous avons observé aucune différence notable entre les deux méthodes. Toutefois, le chargement de la solution dans la poignée en matière plastique peut être avantageux sur des surfaces verticales de peau, par exemple.
- Lancer l'oscillation aiguille et placer le réseau d'aiguilles avec une légère pression sur la peau de l'animal sur le site de tatouage. Puis déplacer l'aiguille oscillant doucement et lentement de façon linéaire pour délivrer l'ADN plasmidique sur toute la zone de tatouage. Maintenir un angle de 90 degrés entre l'aiguille et la peau pour éviterlacérations de la peau.
- Observez la peau. À l'abrasion et l'inflammation sont normaux. Si le saignement se produit, arrêtez le processus de tatouage et de diminuer la profondeur de l'aiguille.
- Poursuivre le mouvement de l'aiguille pendant environ 1 min, puis arrêter le processus de tatouage.
- Utilisez un coton-tige propre pour appliquer une fine couche d'analgésique topique sur le site de tatouage. Analgésiques topiques comme la crème de sulfadiazine d'argent (SSD crème) ou une pommade Neosporin peut aider à soulager la douleur ou la détresse des animaux, et donc il est conseillé de les appliquer avant l'anesthésie disparaît. Observer les animaux, le lendemain des signes de douleur ou de détresse (changement d'allure, inactivité). Réappliquer crème analgésique si les signes persistent.
5. Confirmation de l'expression des antigènes
- 48 h après le traitement tatouage (à noter que différentes constructions PDNA peuvent nécessiter des temps d'expression différents), la souris est euthanasié par le CO 2 narcose. Pour les autresanimaux, reportez-vous aux directives d'euthanasie de votre institution.
- Disséquer la peau au niveau du site de tatouage, et fixer le tissu dans du paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant la nuit.
- Rincer le tissu avec de l'éthanol à 70%, et le transférer dans du PBS 1X pour l'imagerie.
- Examiner l'ensemble du tissu à l'aide d'un microscope confocal pour vérifier les signaux EGFP. En variante, le tissu de la peau peut être noyé dans de la paraffine et examinés en sections sous un microscope à fluorescence.
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Representative Results
L'expression de l'EGFP avec un pic d'excitation à 488 nm et pic d'émission à 509 nm peut être observée dans les cellules de peau de souris. D'une dose de 1,875 ug d'ADN, contenant environ 3 × 10 17 copies du plasmide, on observe habituellement 10-20 signaux EGFP dans les 1 cm 2 tatoués région. Ce nombre relativement faible de cellules transfectées est cohérent avec les résultats d'une étude précédente 3. L'expression de l'EGFP (Figure 1) fournit la preuve que le plasmide EGFP a été livré dans les cellules de peau de l'animal à l'aide de la technique de l'ADN tatouage.
Figure 1. Expression de l'EGFP dans les cellules de la peau 48 heures après le traitement tatouage sur la patte arrière d'une souris BALB / c vu avec un microscope confocal. A) Une projection de signaux EGFP à partir de plusieurs plans focaux. B) expression de l'EGFP dans un chantle cellulaire.
Dépannage
1. Aucune expression de l'antigène est détectée (par exemple pas de signaux EGFP témoins positifs).
- Augmenter la concentration de la solution d'ADN plasmidique par 2 - à 5-fois. Nous recommandons une concentration initiale de 0,2 mg / ml. Concentrations aussi élevées que 5 mg / ml ont été rapportés pour l'ADN tatouage expériences 3.
- Éviter des dommages graves à la peau, car la peau de la souris sur le site de tatouage peut être facilement coupé par les rasoirs et les aiguilles.
- Assurez-vous que la construction d'ADN correspondant à votre expérience.
- Effectuer l'électrophorèse sur gel de s'assurer la majorité de l'ADN plasmidique est en forme circulaire superenroulé ou fermé.
2. Les hémorragies graves ou des dommages à la peau survient sur le site de tatouage.
- Diminution de la profondeur des aiguilles.
- Maintenir un angle de 90 degrés entre le réseau aiguille et la peau.
- Diminuer la force appliquée pendant l'tatouage traitement.
- Diminuer la vitesse du mouvement de tatouage.
3. Le signal de fond est trop élevé lorsque l'imagerie EGFP.
- Utilisez une lame de rasoir neuve de sécurité jetable pour enlever les poils autant que possible avant le tatouage. Parfois, il est nécessaire de se raser à nouveau avant la dissection.
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Discussion
La vaccination par ADN est considéré comme plus sûr que les stratégies de vaccination traditionnels car il ne nécessite pas de manipulation, ou exposer les vaccins, les agents pathogènes vivants ou atténués 4. Toutefois, le résultat de la vaccination ADN dépend fortement de l'itinéraire de livraison. La peau est abondante dans les cellules présentatrices d'antigène, comme les cellules de Langerhans et les cellules dendritiques 1, et donc un site idéal pour la vaccination en termes d'immunogénicité et la facilité d'accès 5,6. En conséquence, la stratégie de vaccination intradermique est l'un des choix les plus populaires pour les vaccins à ADN. Comme le montre cette vidéo, l'ADN tatouage est un moyen simple et prometteur pour administrer un vaccin à ADN par voie intradermique. Fait intéressant, les réactions inflammatoires provoquées par le processus de tatouage pourrait aussi servir de 1,2 adjuvant naturel et puissant. Il a été rapporté que le tatouage ADN peut provoquer une augmentation de jusqu'à 100 fois dans réponses des cellules T chez les singes, par rapport aux réponses des cellules T chez les animaux immunized par voie intramusculaire 7,8. Comparé à d'autres méthodes de prestation dermiques, comme le canon à gènes, ADN tatouage détient plusieurs avantages. Tout d'abord, le tatouage ADN ne nécessite pas de matériel coûteux et des transporteurs, à savoir des particules d'or. Ce serait un énorme avantage en termes de distribution des vaccins, en particulier pour les pays en développement. D'autre part, on sait que la pression d'air élevée peut causer des dommages ADNp en raison de la force de cisaillement, ce qui pourrait diminuer le niveau d'expression de l'antigène. Une étude a montré que les dommages d'ADN de tatouage moins de 3% du total ADNp 9. Enfin, le tatouage ADN peut couvrir une grande surface de la peau, ce qui pourrait susciter une réponse immunitaire plus forte. Dispositifs de tatouage peut également être utilisé pour fournir peptides / protéines vaccins, et se sont avérés induire à la fois humorale et à médiation cellulaire réponse immunitaire 10. Nous utilisons maintenant la peau tatouage régulièrement dans nos expériences sur les animaux dans un premier ADN-protéines boost protocole de vaccination (trois nombres premiers d'ADN suiviepar deux protéines augmente sur une période de 16 semaines), et nous avons réussi à provoquer chez la souris une forte réponse immunitaire contre le VIH-1 gp120.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres du Laboratoire Kong et le Dr Yan Deng chez Core microscopie, Bureau de la science collaborative, NYUMC pour leur aide et soutien technique. Ce travail a été soutenu par une subvention pilote à partir du Centre de New York University for AIDS Research (CFAR, NIH AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
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- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A. DNA vaccines: a review. J. Intern. Med. 253, 402-410 (2003).
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M. DNA vaccines. Jpn. J. Pharmacol. 83, 167-174 (2000).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
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- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
