Summary
एक गैर इनवेसिव myoblast प्रत्यारोपण की सफलता का मूल्यांकन करने का मतलब वर्णित है. विधि एक एकीकृत संलयन रिपोर्टर जीन जीन जिनकी अभिव्यक्ति विभिन्न इमेजिंग रूपात्मकता के साथ imaged किया जा सकता है की रचना का लाभ लेता है. यहाँ, हम एक का इस्तेमाल करते हैं
Protocol
1. रखरखाव और C2C12 myoblasts के प्रचार
- प्लेट एक 75 सेमी 2 फ्लास्क में C2C12 myoblasts और उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल सीरम (पारा DMEM) पूरक भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ 10% की एक अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं को बनाए रखने. कोशिकाओं को किसी भी समय मिला हुआ बनने के रूप में इस myoblastic जनसंख्या गिरेगा की अनुमति न दें. 37 करने के लिए हमेशा गर्म माध्यम ° एक पानी से पहले स्नान करने के लिए उपयोग में सी: मध्यम हर दिन अन्य नोट किया जाना चाहिए बदल दिया है.
- जब myoblasts लगभग 80% मिला हुआ हो, एक नई कुप्पी बीतने कोशिकाओं. संस्कृति मध्यम Aspirate. 4-5 मिलीलीटर हैंक्स संतुलित नमक (HbSS) समाधान के लिए संस्कृति के माध्यम है, जिसमें trypsin - बाधा सीरम के सभी निशान हटाने के साथ कोशिकाओं को धो लें. संक्षेप में 2-3 मिलीलीटर 0.25% (w / v) trypsin EDTA कुप्पी से पक्षपाती myoblasts अलग कर देना समाधान के साथ सेल परत कुल्ला. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए trypsin और इनक्यूबेटर में जगह फ्लास्क Aspirate.
- इस incuba के दौरानtion, HG-DMEM/10% FBS मध्यम 9 मिलीलीटर के साथ एक नई कुप्पी तैयार. Trypsinization बाद, कोशिकाओं और विंदुक 4-5 बार पूरा माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ने के मध्यम में सभी कोशिकाओं के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए. नई कुप्पी सेल निलंबन की 1 मिलीग्राम और 37 पर 5% सीओ 2 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस
2. C2C12 सेल अभिकर्मक
- एक बार कोशिकाओं 50 confluency% तक पहुँच चुके हैं, transfect Invitrogen से निर्माता के निर्देशों के अनुसार. संक्षेप में, 4.5 मिलीग्राम मध्यम OPTI-सदस्य के साथ 90 μl Lipofectamine 2000 अभिकर्मक गठबंधन. एक और ट्यूब में 4.5 मिलीलीटर OPTI-सदस्य के साथ 36 ग्राम संवाददाता सीएमवी trifusion जीन डीएनए गठबंधन. प्रत्येक के लिए गठबंधन और 5 मिनट इंतजार ट्यूब झटका. दोनों ट्यूबों की सामग्री का मिश्रण करने के लिए, धीरे मिश्रण और वास्तव में तीस मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं नोट: एक दूसरे फ्लास्क भी untransfected कोशिकाओं के लिए चाहिए सेट किया जा सकता है कि केवल Lipofectamine और OPTI-सदस्य प्राप्त करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा.
- मध्यम C2C12 कोशिकाओं से निकालें और जोड़ने के 15.5मिलीलीटर ताजा HG-DMEM/10% FBS मध्यम. अभिकर्मक मध्यम जोड़ें कुल मात्रा 20 मिलीग्राम लाने.
- कोशिकाओं को कम से कम 20 घंटे के लिए रातोंरात 37 पर transfect करने की अनुमति दें डिग्री सेल्सियस
- अगले दिन, अभिकर्मक मध्यम aspirate और 10 मिलीलीटर FBS HG-DMEM/10% जोड़ने के.
- एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं देखें. दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और लाल प्रतिदीप्ति छवियों पर कब्जा (एक TRITC फिल्टर घन का उपयोग करते हुए, mrfp पूर्व / उन्हें: 584 एनएम / 607). आरएफपी व्यक्त अभिकर्मक दक्षता उत्पन्न देखने के कई क्षेत्रों के लिए उज्ज्वल क्षेत्र के अंतर्गत देखा कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित प्रतिदीप्ति के नीचे देखा कोशिकाओं की संख्या की गणना करें.
3. सेल / Survivability MTT परख का आकलन
- एक दिन अभिकर्मक, 1x10 प्लेट 5 एक 24-अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक कुएं में C2C12 कोशिकाओं को पहले. कोशिकाओं HG-DMEM/10% FBS में 500 μl मात्रा में चढ़ाया जाना चाहिए.
- अगले दिन, transfect myoblasts रात के रूप में पहले से वर्णित है. अभिकर्मक Reagen के लिए निर्माता के सुझावों का पालन करेंएक 24-अच्छी तरह से थाली के लिए टी मात्रा. केवल एक नियंत्रण के रूप में Lipofectamine (डीएनए) के साथ कुओं का एक सेट सेते हैं. प्रतिदीप्ति तहत कोशिकाओं देखें करने के लिए सुनिश्चित करें कि उचित अभिकर्मक हुआ है.
- FBS में HG-DMEM/10% 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर thiazolyl नीले tetrazolium ब्रोमाइड (MTT) के साथ अभिकर्मक मध्यम और सेते myoblasts निकालें. आठ ट्रांसफ़ेक्ट कुओं के लिए D-Luciferin जोड़ें, और चार घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- कुओं से मध्यम निकालें. एक अच्छी तरह से 180 isopropanol μl जोड़कर नीले formazan क्रिस्टल solubilize. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मंथन.
- एक 96-अच्छी तरह से थाली में किसी भी वेग, विंदुक समाधान से बचना और 575 एनएम पर absorbance पढ़ें.
4. प्रत्यारोपण के लिए myoblasts की तैयारी
- मध्यम निकालें, HbSS साथ myoblasts धोने, और कोशिकाओं trypsinize के रूप में 1.1 में उल्लिखित है.
- पूरा मध्यम के 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं को स्थगित कर देते हैं.
- एक hemocytometer का प्रयोग, कोशिकाओं गिनती 10 6 myoblasts युक्त संस्करणों उत्पन्न. पिपेट वॉलबाँझ 1.5 मिलीलीटर microtubes में ume. ~ 10% की एक अभिकर्मक दक्षता के साथ इन मूल्यों से संकेत मिलता है कि 100.000 luciferase व्यक्त कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद जीई ExploreOptix स्कैनर पर detectable रहे हैं.
- 15 μl के अंतिम इंजेक्शन मात्रा प्राप्त करने के लिए, 10 6 C2C12 कोशिकाओं से युक्त. यदि आवश्यक हो, 2,000 rpm पर एक मिनट के लिए microtubes अपकेंद्रित्र. ध्यान एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला aspirate. पारा DMEM FBS कमी की 15 μl में कोशिकाओं को स्थगित कर देते हैं.
5. सेल आरोपण
- 2% isoflurane 2/2 हे के साथ माउस anesthetize. पृष्ठीय पिछले अंग क्षेत्र से बाल प्लक. 1.5% isoflurane 2/2 हे संज्ञाहरण बनाए रखें.
- सुनिश्चित करें C2C12 myoblasts अच्छी तरह से निलंबित कर दिया है. एक प्रवण स्थिति में माउस के साथ, पिछले अंग का विस्तार और एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करने के लिए एक 30 डिग्री कोण में gastrocnemius की मांसपेशी के पार्श्व सिर में सीधे कोशिकाओं इंजेक्षन. सही पिछले अंग और untransfected myoblasts int में ट्रांसफ़ेक्ट myoblasts इंजेक्षनcontralateral (बाएं) पिछले अंग ओ.
- एक आधारभूत bioluminescence स्कैन प्रदर्शन: जल्दी ऑप्टिकल स्कैनर में मंच पर माउस, हस्तांतरण एक प्रवण स्थिति में माउस बिछाने. चतनाशून्य करनेवाली औषधि लाइन मिला. यह सुनिश्चित करने के लिए माउस anesthetized रहता है, एक दूसरे व्यक्ति के लिए उपस्थित होने के लिए चतनाशून्य करनेवाली औषधि लाइन हुक चाहिए जबकि अन्य स्थानों स्कैनर में पशु.
- धीरे पिछले अंग का विस्तार तो इंजेक्शन के क्षेत्र में दिखाई देता है. चिकित्सा टेप के रूप में एक कोमल चिपकने के साथ जगह में टेप हिंद अंग.
- कक्ष बंद करें और सुनिश्चित करें कि कोई प्रकाश स्कैनर के इंटीरियर का उपयोग कर सकते हैं, इस पृष्ठभूमि के रूप में पाया संकेत वृद्धि होगी. स्कैनर पैरामीटर bioluminescence इमेजिंग के लिए अपने निर्माता के निर्देशों में शामिल करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, यह सुनिश्चित करें लेजर "चुना है.
- Plucked क्षेत्र और शुरू स्कैन के आसपास ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्रा.
6. Fluc सब्सट्रेट, D-Luciferin, के MDX माउस में इंजेक्शन
<ol>7. BLI ल्यूक व्यक्त MPCs DMD माउस मॉडल में प्रत्यारोपण के बाद लक्ष्य
- तेज अवधि के बाद, माउस फिर anesthetize, के रूप में 5.1 में वर्णित है.
- माउस वापस ऑप्टिकल स्कैनर और स्थानांतरण पृष्ठभूमि स्कैन के रूप में एक ही तरीके से एक और bioluminescence स्कैन प्रदर्शन.
- हालांकि एक 20 मिनट के तेज अवधि अधिक से अधिक संकेत तीव्रता प्रदान करना चाहिए, बाद में एक स्कैन किया जा सकता है.
- छवि अधिग्रहण के पूरा होने पर, अपने संस्थागत पशु की आचार समिति और पशु देखभाल (CCAC) पर कनाडा परिषद द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार माउस का बलिदान. पिछले अंग मांसपेशियों और जगह तुरंत मैं पृथक करेंn 10 formalin% पैराफिन embedment के लिए तय करने के लिए. प्रदर्शन luciferase लिए immunohistochemistry धुंधला हो myoblasts intramuscular इंजेक्शन की पुष्टि करने के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
50-60% confluency पर, C2C12 myoblasts transiently उपर्युक्त संलयन रिपोर्टर जीन जुगनू luciferase से बना निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे fluc], monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन [mrfp] और sr39 thymidine kinase [sr39tk] (चित्रा 1 ए). अभिकर्मक दक्षता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (आंकड़े 1 बी, सी) के माध्यम से गणना की गई, हमारे संवाददाता में निर्माण mrfp अनुक्रम का उपयोग कर रही है. सेल survivability BLI सब्सट्रेट, डी Luciferin (चित्रा 1D) के साथ लेबलिंग से प्रभावित नहीं था. अभिकर्मक के बाद, लगभग 100.000 mrfp व्यक्त myoblasts intramuscularly MDX चूहों के gastrocnemius पेशी निर्धारित किया है पहले, पांडुलिपि प्रस्तुत में प्रत्यारोपित किया गया, 100.000 untransfected कोशिकाओं इसी तरह एक नियंत्रण के रूप में contralateral पिछले अंग में प्रत्यारोपित किया गया था. तुरंत बाद सेल आरोपण, चूहों अंतःक्षिप्त थे intraperitoneally 150 मिलीग्राम / D-lucife किलो के साथ (आईपी)rin. ~ का एक तेज अवधि के बाद 20 मिनट, चूहों एक छोटे जानवर ऑप्टिकल स्कैनर (जीई ExplorOptix ब्लैक बॉक्स कि जीना जानवर bioluminescence और प्रतिदीप्ति के लिए सुसज्जित है) पर imaged थे. जैसा कि पहले दोनों इन विट्रो और बाद आरोपण D-Luciferin तेज (प्रस्तुत पांडुलिपि) में प्रदर्शन किया, (2 चित्रा) कोई untransfected कोशिकाओं में detectable bioluminescence के साथ myoblasts fluc व्यक्त करने के लिए विशिष्ट था. Immunohistochemistry myoblasts की इंट्रामस्क्युलर प्रत्यारोपण (3 चित्रा) की पुष्टि की
चित्रा 1 के योजनाबद्ध सीएमवी trifusion रिपोर्टर (ए) का निर्माण, brightfield / प्लाज्मिड trifusion रिपोर्टर (बी, सी) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट C2C12 myoblasts प्रतिदीप्ति छवियों, MTT परख BLI सब्सट्रेट, D-दीप्तीकर के साथ लेबलिंग के बाद C2C12 सेल survivability का आकलन. (डी).
चित्रा 2. Bioluminescence इमेजिंग (BLI) ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) plucked पिछले अंग क्षेत्र जहां myoblasts इंजेक्ट कर रहे हैं (ए) संलग्न करने के लिए तैयार की है. Bioluminescence एक पृष्ठभूमि स्कैन (बी) के दौरान पता नहीं है. D-Luciferin के इंजेक्शन के बाद 23 मिनट में, एक स्पष्ट संकेत जहां luciferase व्यक्त myoblasts इंजेक्ट कर रहे हैं सही पिछले अंग से पता चला है. नहीं bioluminescence contralateral हिंद untransfected myoblasts (सी) के साथ इंजेक्शन अंग में पाया जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
/ upload/50119/50119fig3.jpg ">
चित्रा 3. आईएचसी एक जुगनू luciferase एंटीबॉडी का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट C2C12 कोशिकाओं की इंट्रामस्क्युलर आरोपण की पुष्टि करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस अध्ययन में, हम प्रत्यारोपण के बाद एक तेज और विश्वसनीय आणविक इमेजिंग, रिपोर्टर जीन दृष्टिकोण गैर invasively लक्ष्य myoblasts / MPCs का वर्णन किया है. जबकि इस अध्ययन के माध्यम से bioluminescense (BLI) इमेजिंग, जिस तरीके में कोशिकाओं को लक्षित कर रहे हैं, वास्तव में, आसानी से कर सकते हैं कि कोशिकाओं के आरोपण के माध्यम से सेल engraftment के एक अनुदैर्ध्य का आकलन करने के लिए हो सकता है, लागू अल्पकालिक प्रतिरोपित MPCs के स्थानीयकरण को दर्शाता है stably व्यक्त रिपोर्टर जीन. यह अंत करने के लिए, हमारे समूह ट्रांसजेनिक माउस लाइनों है कि एकीकृत रिपोर्टर जीन बंदरगाह उत्पन्न किया है. केवल रिपोर्टर जीन व्यक्त कोशिकाओं Luciferin oxidize BLI दृश्य का उपयोग कर के लिए फोटॉनों उत्पादन. चूंकि D-Luciferin ऑक्सीकरण जीन अभिव्यक्ति पर निर्भर है, यह एक शक्तिशाली तकनीक है जो गैर invasively छवि व्यवहार्य प्रतिरोपित कोशिकाओं के साथ. इन ट्रांसजेनिक चूहों और FACS के माध्यम से अलग उपग्रह कोशिकाओं (अजा) से काटा स्नायु ऊतक वास्तव targete हो सकता हैMDX चूहों में आरोपण के बाद. इसके अतिरिक्त, हम एक मांसपेशी विशेष प्रमोटर के प्रयोग के माध्यम से उनकी भिन्नता की स्थिति पर नज़र रखने के आगे और आणविक इमेजिंग प्रौद्योगिकी की उपयोगिता और महत्व heightening, जैसे यहां प्रस्तुत DMD अनुसंधान के क्षेत्र (प्रस्तुत पांडुलिपि) कर सकते हैं. अपनी तेज़ी और कम लागत के अलावा, BLI गैर विषैले है, यह छोटे जानवरों की लगातार इमेजिंग के लिए एक आकर्षक विकल्प बना रही है. यह फीचर, के रूप में अच्छी तरह से अपने उच्च विशिष्टता के रूप में, Duchenne पेशी dystrophy के पूर्व नैदानिक रोग मॉडल में चिकित्सकीय लागू पालतू जानवर के रूप में इस तरह की तकनीकों को शामिल अध्ययन करने के लिए आगे बढ़ने से पहले myoblast प्रतिस्थापन चिकित्सा को परिष्कृत करने में अमूल्य हो जाएगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए संजीव गंभीर fluc/mrfp/sr39tk रिपोर्टर जीन के उपहार के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम कनाडा के स्टेम सेल (SCN) नेटवर्क, और यिशै यात्रा फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. Muscle stem cells. J. Pathol. 197, 457-467 (2002).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
