Summary
非侵入性的方法来评估成肌细胞移植的成功。该方法利用一个统一的融合的记者基因组成的基因的表达，可以被不同的成像方式成像。在这里，我们使用
Abstract
杜氏进行性肌营养不良症（DMD）是一种严重的遗传性神经肌肉疾病，影响1，在3500名男生，其特点是渐进性肌肉变性1，2。患者，有能力的居民肌肉卫星细胞（SC）的再生受损的肌纤维变得越来越低效4。因此，移植的肌肉祖细胞器（MPC）/成肌细胞从健康到DMD是一种很有前途的治疗方法。利用干细胞治疗的主要限制因素，然而，植入的细胞，长期监测和评价其有效性是缺乏可靠的成像技术。在这里，我们描述了一种非侵入性的，实时的方法来评价成肌细胞移植的成功。该方法利用了一个统一的融合的基因组成的报告基因（萤火虫荧光素酶[ 涨落 ]，单体红色荧光蛋白[MRFP]和SR39胸苷激酶[sr39tk基因 ]），其expre裂变可以与不同的成像模式9，10成像。多种成像模式，包括正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层显像（SPECT），磁共振成像（MRI），光学成像，和高频率的三维超声现已有售，每一个具有独特的优势和局限性11。生物发光成像（BLI）的研究，例如，具有的优点是相对低的成本和高吞吐量。这是因为这个原因，在本研究中，我们利用鼠标后的萤火虫荧光素酶（ 涨落 ）报告基因序列内包含为短期的本地化的可行的C2C12细胞的融合基因和生物发光成像（BLI）植入到模型的DMD（肌肉萎缩症的X染色体上[MDX]鼠标）12-14。更重要的是，BLI为我们提供了一个方法来检查标记的多用途储值卡植入后的动力学，将是有益的跟踪多次在T细胞IME和下面的迁移。我们的记者基因的方法还使我们能够合并在一个单一的生物体内的多种成像模式，断层性质，精细空间分辨能力扩展到较大 的动物和人类的10,11，，PET将形成未来工作的基础上，我们建议可以方便快速的翻译方法在细胞的临床前模型和临床应用开发。
Protocol
1。 C2C12成肌细胞的维护和传播
- 板C2C12细胞在75cm 2的烧瓶中，并在高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle的血清（HG-DMEM）中至最终浓度为10％的牛胎儿血清（FBS）补充与维持细胞。不要让细胞变得汇合在任何时间，因为这会消耗成肌人口。应该改变每一天。 注：总是温暖的介质中，以37°C的水洗澡前使用。
- 当成肌细胞成为约80％汇合时，到新的烧瓶中的传代细胞。吸液培养基中。 4-5毫升Hanks平衡盐溶液（HBSS）删除所有的痕迹，其中含有胰蛋白酶抑制血清的培养基洗涤细胞。简言之冲洗的细胞层与2-3毫升的0.25％（重量/体积）的胰蛋白酶-EDTA溶液，离解的粘合成肌细胞从烧瓶中。吸干胰蛋白酶和烧瓶中放入培养箱在37℃下5分钟。
- 在此温浴TION，准备一个新的烧瓶9毫升HG-DMEM/10％FBS培养基。胰蛋白酶消化后，加入10毫升的完全培养基，细胞和吸液管的4-5倍，以确保在介质中的所有单元格的集合。的新烧瓶中加入1毫升的细胞悬浮液中，并在5％CO 2孵育在37℃下
2。 C2C12细胞转染
- 一旦细胞达到50％汇合时，转染，根据制造商的说明从Invitrogen公司。简要地说，将90微升Lipofectamine 2000试剂，用4.5ml的OPTI-MEM培养基。在另一试管中，OPTI-MEM为4.5毫升36微克的CMV-trifusion记者基因DNA结合。滑动各管结合起来，并等待5分钟。结合两个管子的内容，轻轻混匀，在室温下培养了整整30分钟。 注：第二个烧瓶中也可以设置为未转染的细胞，只有收到脂质体和OPTI-MEM作为阴性对照。
- 删除介质C2C12细胞，并添加15.5毫升新鲜HG-DMEM/10％FBS培养基中。转染培养基，将总体积为20毫升。
- 让细胞转染过夜至少20小时，在37°C。
- 第二天，吸转染培养基，并添加10毫升HG-DMEM/10％FBS。
- 查看在倒置荧光显微镜下的细胞。拍摄时，可同时捕捉明亮的领域和红色荧光图像（使用TRITC过滤器的多维数据集的MRFP前/ EM：六百○七分之五百八十四纳米的）。除以总数下明场观察的视图来生成转染效率的多个字段的细胞的荧光下观察RFP-表达细胞数进行计数。
3。细胞的生存能力/ MTT法评估
- 前一天，转染，板1×10 5 C2C12细胞在24孔板，每孔。细胞应在500μl体积HG-DMEM/10％FBS的镀。
- 第二天，转染的成肌细胞过夜如先前所述。按照制造商的建议转reagen吨量的24孔板。孵育一组只与Lipofectamine（不含DNA）作为对照井。查看细胞，荧光，以确保适当的转染的发生。
- 将转染培养基，并培育成肌细胞与5毫克/毫升噻唑蓝四甲基偶氮唑蓝（MTT）HG-DMEM/10％FBS。加入D-荧光素转染井8，四个小时，并在37℃下孵育。
- 从井中取出介质。溶解蓝色甲臜晶体通过加入180微升异丙醇，以各孔。摇动15分钟，在37℃下。
- 避免的任何沉淀，吸移管溶液成96孔板，并读取在575 nm处的吸光度。
4。制备成肌细胞进行移植
- 删除介质，与HBSS洗成肌细胞，细胞中列出的1.1 trypsinize。
- 4 ml完全培养基中重新悬浮细胞。
- 使用血球计数器，计数细胞产生含有10 6成肌细胞的体积。用移液管卷UME进入无菌1.5毫升微管。有了一个〜10％的转染效率，这些值表明，100000的荧光素酶表达的细胞是可以检测的移植后的的GE ExploreOptix扫描器上。
- 达到最终的注射体积为15微升，含有10 6 C2C12细胞。如果有必要，在2,000 rpm离心微管一分钟。小心地用吸管吸出上清液。重新悬浮在15μl的HG-DMEM缺乏FBS的细胞。
5。细胞移植
- 麻醉，用2％异氟烷/ 2％O 2的鼠标。拨动头发从后肢背侧区。异氟醚/ 2％的O 2，在1.5％的维持麻醉。
- 确保C2C12成肌细胞被暂停。用鼠标在俯卧位，延长后肢和使用胰岛素注射器直接注入细胞，成30°角腓肠肌外侧头。转染的成肌细胞注入右后肢和未转染的成肌细胞的诠释Ø肢体对侧（左）。
- 执行基准的生物冷光扫描：快速将鼠标移动到舞台奠定了鼠标的光学扫描仪，在俯卧位。连接的麻醉行。为了确保的鼠标停留麻醉，第二个人应该是挂钩的麻醉线，而其他地方的动物在扫描仪。
- 轻轻延长后肢，所以喷射的区域是可见的。带后肢的地方，一个温和的粘合剂，如医用胶带。
- 关闭的腔室，并确保没有光可以访问的扫描仪的内部，因为这会增加检测到的背景信号。应设置扫描仪参数包括生物发光成像制造商的说明。具体而言，确保“无激光”的选择。
- 周围画一个地区的利益（投资回报率）的弹拨区，并开始扫描。
6。 mdx小鼠注射涨落基板，D-荧光素，
<OL>7。 BLI目标吕克表达的多用途储值卡的DMD小鼠模型植入
- 摄取后期间，再次麻醉小鼠，如在5.1中描述。
- 鼠标传输的光学扫描器，并作为背景扫描中相同的方式执行另一个生物发光扫描。
- 虽然20分钟摄取期间应该提供最大的信号强度，随后的扫描可以被执行。
- 图像采集完成后，牺牲的鼠标，根据实验动物伦理委员会和加拿大动物保护（CCAC）理事会的指导方针。我立刻隔离后肢肌肉和地方N 10％福尔马林固定的石蜡包埋。荧光素酶进行免疫组化染色证实成肌细胞肌肉注射。
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Representative Results
当50-60％汇合，C2C12细胞瞬时转染的与上述融合报告基因构建体组成的萤火虫荧光素酶[ 涨落 ]，单体红色荧光蛋白[MRFP]和SR39胸苷激酶[sr39tk基因 ]（ 图1A）。计算转染效率，通过荧光显微镜（ 图1B中的C），在我们的记者构造使得的MRFP序列使用。不影响细胞的生存能力，通过标记与BLI基板上，D-荧光素（ 图1D）。转染后，约100,000的MRFP表达成肌细胞植入肌内到腓肠肌mdx小鼠（预先确定，手稿提交）; 100000未转染的细胞，同样注入对侧后肢作为对照。紧随细胞移植，小鼠腹腔注射（IP）与150 mg / kg的D-lucifeRIN。吸收期〜20分钟后，小鼠的小动物光学扫描仪（GE的ExplorOptix黑盒子，装有活的动物生物发光和荧光）成像。正如前面表明， 在体外和植入后 （手稿呈交）D-荧光素摄取的时间是特定的波动表达的成肌细胞，在未转染的细胞（ 图2）与没有检测到的生物发光。免疫组化证实肌肉内移植的成肌细胞（ 图3）
图1示意图CMV-trifusion记者的结构（A）;明场/荧光图像的C2C12成肌细胞转染与trifusion记者质粒（B，C）; MTT法评估后C2C12细胞的生存与的BLI基板，D-路西法的标签。 （D）中。
图2。生物发光成像（BLI）的感兴趣区域（ROI）提取，附上的弹拨后肢的地方，成肌细胞注入（A）。还没有背景扫描过程中检测到（B）的生物发光。注射D-荧光素，在23分钟后，一个明确的信号被检测到荧光素酶表达的成肌细胞被注入其中的右后肢。生物发光检测对侧后肢注射未转染的成肌细胞（C）。 点击此处查看大图 。
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图3。 IHC使用萤火虫荧光素酶抗体确认肌内植入转染C2C12细胞。
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Discussion
在这项研究中，我们已经描述了一个快速和可靠的分子成像，记者基因的方法，以非侵入性的目标，成肌细胞/多用途储值卡的移植。虽然这项研究表明， 短期的本地化移植的多用途储值卡，其实很容易地应用于细胞移植的纵向评估，通过植入的细胞，细胞的方式 ，有针对性的通过bioluminescense成像（BLI），稳定表达报道基因。为此，本集团已怀有统一的报告基因的转基因小鼠品系。只有表达报告基因的细胞氧化D-荧光素产生光子的可视化使用BLI。由于D-荧光素的氧化依赖于基因的表达，这是一个功能强大的技术，以便以非侵入图像可行的移植细胞。肌肉组织从这些转基因小鼠，并通过流式细胞仪分离出卫星细胞（SC）的收获的确可以targete的d以下植入mdx小鼠。此外，我们还可以通过使用的肌肉特异性启动子，跟踪其分化状态，还加高的有用性和重要性的分子成像技术中，如本文中所提出的，到DMD的研究领域（手稿呈交）。除了它的快速性和低成本，BLI是无毒的，使它有吸引力的选择频繁成像的小动物。此功能，以及其特异性高，是非常宝贵的，然后推进到临床应用的研究，涉及的技术，如PET提炼成肌细胞替代疗法在临床前的杜氏进行性肌营养不良症的疾病模型。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢Sanjiv甘比尔的fluc/mrfp/sr39tk报告基因的礼物。这项工作是由加拿大干细胞网络（SCN），和杰西之旅基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
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