本文描述了一种评估成肌细胞移植效果的非侵入性方法。该方法利用一种统一的融合报告基因，该基因由可通过不同成像方式检测其表达的基因组成。在此，我们采用fluc报告基因序列，通过生物发光成像技术对靶细胞进行示踪。
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本文内容
摘要
摘要
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种严重的遗传性神经肌肉疾病，每3,500名男孩中就有1人受累，其特征是进行性肌肉退化1, 2。在患者体内，驻留的肌肉卫星细胞（SCs）再生受损肌纤维的能力逐渐下降4。因此，将来自健康供体的肌肉前体细胞（MPCs）/成肌细胞移植是一种具有前景的DMD治疗策略。然而，干细胞治疗应用的一个主要限制是缺乏可靠的长期监测移植细胞的成像技术，以及对其疗效进行评估的手段。本文中，我们描述了一种无创、实时评估成肌细胞移植效果的方法。该方法利用一种由多个基因（萤火虫荧光素酶 [fluc]、单体红色荧光蛋白 [mrfp] 和 sr39 胸苷激酶 [sr39tk]）组成的融合报告基因，其表达可通过多种成像方式检测9, 10。目前已有多种成像方式可供选择，包括正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、磁共振成像（MRI）、光学成像以及高频三维超声，每种技术各有其独特的优势与局限性11。例如，生物发光成像（BLI）具有成本相对较低和高通量的优点。正因如此，在本研究中，我们利用融合基因中包含的萤火虫荧光素酶（fluc）报告基因序列及生物发光成像（BLI）技术，对移植至DMD小鼠模型（X染色体连锁肌营养不良小鼠[mdx小鼠]）后的存活C2C12成肌细胞进行短期定位12-14。重要的是，BLI为我们提供了检测标记MPCs在移植后动力学行为的手段，并可用于在时间和迁移过程中的多次细胞追踪。我们的报告基因策略还允许在同一个活体受试者中整合多种成像方式；鉴于PET具备断层成像特性、精细的空间分辨率以及可扩展至较大动物和人类的能力10,11，它将成为未来研究的基础，我们建议该方法可能有助于将细胞水平开发的技术快速转化为临床前模型乃至临床应用。
方案
1. C2C12 成肌细胞的维持与传代培养
- 将C2C12成肌细胞接种于75 cm2培养瓶中，并在高糖Dulbecco改良Eagle培养基（HG-DMEM）中培养，添加胎牛血清（FBS）至终浓度为10%。在整个培养过程中切勿使细胞长至完全汇合，以免耗尽成肌细胞群体。每隔一天更换一次培养基。注意：使用前务必在水浴中将培养基预热至37 °C。
- 当成肌细胞汇合度达到约80%时，将细胞传代至新的培养瓶。吸除培养液，用4–5 ml Hank平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞，以彻底去除含有胰酶抑制剂的血清。随后用2–3 ml 0.25%（w/v）胰酶-EDTA溶液短暂冲洗细胞层，使贴壁的成肌细胞从培养瓶表面解离。吸除胰酶溶液，将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育5分钟。
- 在此孵育期间，准备一个新的培养瓶，加入9 ml HG-DMEM/10% FBS完全培养基。胰酶消化结束后，向细胞中加入10 ml完全培养基，吹打4–5次以确保所有细胞均被悬浮并收集到培养基中。取1 ml细胞悬液接种至新培养瓶中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
2. C2C12 细胞转染
- 当细胞达到50%融合度时，根据Invitrogen公司的说明书进行转染。简言之，将90 μl Lipofectamine 2000试剂与4.5 ml OPTI....
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结果
当细胞融合度达到50-60%时，将C2C12成肌细胞瞬时转染上述融合报告基因构建体，该构建体由萤火虫荧光素酶[fluc]，单体红色荧光蛋白[mrfp] 和 sr39 胸苷激酶 [sr39tk](图1A）。转染效率通过荧光显微镜计算（图1B、C），利用 mrfp 报告基因构建体中的序列。使用生物发光成像底物D-荧光素标记对细胞存活率无影响（图1D)。转染后，将约100,000个表达mrfp的成肌细胞经肌内注射植入mdx小鼠的腓肠肌中（此前已确定，论文已投稿）；作为对照，将100,000个未转染细胞以相同方式植入对侧后肢。细胞移植后立即经腹腔注射（IP）150 mg/kg D-荧光素酶底物。经过约20分钟的摄取期后，使用小动物光学成像仪（GE ExplorOptix黑色盒子，配备活体动物生物发光与荧光检测功能）对小鼠进行成像。如先前研究所示，两者均 体外 和 植入后 （稿件已提交）D-荧光素的摄取特异性地发生在表达fluc的成肌细胞中.......
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讨论
在本研究中，我们描述了一种快速且可靠的分子成像技术——报告基因方法，可用于无创地示踪移植后的成肌细胞/肌肉前体细胞（MPCs）。尽管本研究通过生物发光成像（BLI）展示了移植MPCs的短期定位，但所采用的细胞示踪方式实际上可轻松扩展应用于细胞植入的长期动态评估，只需移植稳定表达报告基因的细胞即可实现。为此，我们的研究团队已构建了携带统一报告基因的转基因小鼠品系。只有表达该报告基因的细胞才能将D-荧光素氧化，从而产生光子，供BLI可视化检测。由于D-荧光素的氧化依赖于基因表达水平，因此该技术是一种用于无创成像存活移植细胞的强大工具。从这些转基因小鼠中获取的肌肉组织，以及通过FACS分离得到的卫星细胞（SCs），在植入mdx小鼠体内后均可实现有效示踪。此外，通过使用肌肉特异性启动子，我们还可追踪这些细胞的分化状态，进一步提升了本文所介绍的此类分子成像技术在杜氏肌营养不良症（DMD）研究领域中的实用价值与重要意义（相关论文已投稿）。除快速、低成本外，BLI还具有无毒性优势，使其成为小动物频繁成像的理想选择。这一特性及其高特异性，将在推进杜氏肌营养不良症的临床前疾病模型研究中发挥不可估量的作.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Sanjiv Gambhir 惠赠 fluc/mrfp/sr39tk 报告基因。本研究由加拿大干细胞网络（The Stem Cell Network，SCN）和 Jesse's Journey 基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C2C12 成肌细胞 | ATCC | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Life Technologies | 12800-017 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| 汉克斯平衡盐溶液 | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-荧光素 | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml 溶于 PBS |
参考文献
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
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