Summary
A mezzi non invasivi per valutare il successo del trapianto di mioblasti è descritto. Il metodo si avvale di un gene reporter di fusione unificato composto da geni la cui espressione può essere ripreso con differenti modalità di imaging. Qui, si fa uso di un
Abstract
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave malattia genetica neuromuscolare che colpisce 1 su 3.500 maschi, ed è caratterizzata da degenerazione muscolare progressiva 1, 2. In pazienti, la capacità delle cellule satelliti muscolari residenti (SC) per rigenerare miofibre danneggiate diventa sempre più inefficiente 4. Pertanto, il trapianto di cellule progenitrici muscolari (PPM) / mioblasti in soggetti sani è un approccio terapeutico promettente per DMD. Una limitazione importante per l'uso di cellule staminali terapia, tuttavia, è una mancanza di tecnologie di imaging affidabili per il monitoraggio a lungo termine di cellule impiantate, e per valutare la sua efficacia. Qui, descriviamo un non-invasiva, in tempo reale approccio per valutare il successo del trapianto di mioblasti. Questo metodo si avvale di un gene reporter di fusione unificato composto da geni (lucciola luciferasi [fluttuazioni], proteina monomerica rosso fluorescente [MRFP] e SR39 timidina chinasi [sr39tk]), il cui expression può essere ripreso con diverse modalità di imaging 9, 10. Una varietà di modalità di imaging, tra cui la tomografia ad emissione di positroni (PET), emissione di singoli fotoni SPECT (tomografia computerizzata), risonanza magnetica (MRI), imaging ottico, e ad alta frequenza 3D ad ultrasuoni sono ora disponibili, ognuna con vantaggi e limiti 11. Di imaging bioluminescenza (BLI) studi, per esempio, hanno il vantaggio di essere relativamente basso costo e ad alta produttività. E 'per questa ragione che, in questo studio, si fa uso della luciferasi di lucciola (fluc) sequenza di gene reporter contenuto all'interno del gene di fusione e di imaging bioluminescenza (BLI) per il breve termine localizzazione di mioblasti C2C12 vitali dopo l'impianto in un topo modello di DMD (distrofia muscolare sul cromosoma X [mdx] del mouse) 12-14. Soprattutto, BLI ci fornisce un mezzo per esaminare la cinetica di PPM etichettati post-impianto, e sarà utile per monitorare le cellule ripetutamente time e migrazione seguente. Il nostro approccio gene reporter, inoltre, ci permette di unire diverse modalità di imaging in un unico soggetto vivente, data la natura tomografica, fine risoluzione spaziale e la capacità di scalare fino a più grandi animali ed esseri umani 10,11, PET costituirà la base del lavoro futuro che abbiamo suggeriscono può facilitare la traduzione rapida di metodi sviluppati nelle cellule ai modelli preclinici e alle applicazioni cliniche.
Protocol
1. Mantenimento e la moltiplicazione di mioblasti C2C12
- Piastra mioblasti C2C12 in un pallone da 2 cm 75 e mantenere le cellule in siero elevato glucosio Dulbecco Modified Eagle (HG-DMEM) supplementato con siero fetale bovino (FBS) ad una concentrazione finale del 10%. Non permettere alle cellule di confluire in qualsiasi momento, in quanto ciò riducono la popolazione myoblastic. Terreno deve essere cambiato ogni altro giorno Nota:. Media sempre calda a 37 ° C in un bagno di acqua prima dell'uso.
- Quando mioblasti diventano circa l'80% confluenti, le cellule di passaggio a un nuovo pallone. Aspirare il terreno di coltura. Lavare le cellule con la soluzione di 4-5 ml Sale Hanks Balanced (HBSS) per rimuovere tutte le tracce di terreno di coltura, che contiene tripsina-inibizione siero. Sciacquare brevemente strato di cellule con 2-3 ml 0,25% (w / v) di tripsina-EDTA soluzione di dissociare i mioblasti aderenti nel matraccio. Aspirare tripsina e pallone posto in incubatore a 37 ° C per 5 min.
- Durante questa incubazionezione, preparare un pallone nuovo con 9 ml di terreno HG-DMEM/10% FBS. Dopo tripsinizzazione, aggiungere 10 ml di terreno completo alle cellule e pipetta 4-5 volte per assicurare la raccolta di tutte le cellule nel mezzo. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare al pallone nuovo e incubare in 5% CO 2 a 37 ° C.
2. C2C12 cellulare Transfection
- Una volta che le cellule hanno raggiunto il 50% di confluenza, trasfettare secondo le istruzioni del produttore da Invitrogen. In breve, unire 90 microlitri Lipofectamine 2000 reagente con 4,5 ml OPTI-MEM. In un altro tubo, unire 36 mg CMV-DNA trifusion gene reporter con 4,5 ml di OPTI-MEM. Flick ogni tubo di combinare ed attendere 5 min. Combinare contenuto di entrambe le provette, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Nota: Un pallone secondo dovrebbe anche essere impostato per cellule non trasfettate che solo ricevere Lipofectamine e OPTI-MEM per servire come controllo negativo.
- Estrarre il supporto di cellule C2C12 e aggiungere 15,5ml di terreno fresco HG-DMEM/10% FBS. Aggiungere mezzo trasfezione per portare il volume totale di 20 ml.
- Permettere alle cellule di trasfettare notte per almeno 20 ore a 37 ° C.
- Il giorno dopo, aspirare media trasfezione e aggiungere 10 ml di HG-DMEM/10% FBS.
- Guarda le cellule sotto un microscopio invertito a fluorescenza. Capture sia in campo chiaro e rosso immagini di fluorescenza (utilizzando un cubo TRITC filtro; MRFP ex / em: 584/607 nm). Contare il numero di cellule che esprimono RFP-visti in fluorescenza diviso per il numero totale di cellule viste al campo chiaro per più campi di immagine per generare efficienza di trasfezione.
3. Valutazione della sopravvivenza cellulare / MTT test
- Un giorno prima della transfezione, piastra 1x10 5 cellule C2C12 in ciascun pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Cellule devono essere placcato in 500 volumi microlitri HG-DMEM/10% FBS.
- Giorno successivo, mioblasti trasfezione overnight come precedentemente descritto. Segui i suggerimenti del produttore per la trasfezione Reagenvolumi t per 24 pozzetti. Incubare una serie di pozzi con Lipofectamine solo (senza DNA) come controllo. Guarda cellule sotto fluorescenza per garantire che la transfezione corretta è verificato.
- Rimuovere medie trasfezione e mioblasti incubare con 5 mg / ml tiazolil blu tetrazolio bromuro (MTT) in HG-DMEM/10% FBS. Aggiungere D-luciferina a otto dei pozzi trasfettate, e incubare a 37 ° C per quattro ore.
- Estrarre il supporto da pozzi. Solubilizzare cristalli blu formazano aggiungendo 180 microlitri isopropanolo a ciascun pozzetto. Agitare a 37 ° C per 15 min.
- Evitando ogni soluzione pipetta precipitato in una piastra a 96 pozzetti e leggere l'assorbanza a 575 nm.
4. Preparazione di mioblasti per il trapianto
- Estrarre il supporto, lavare con HBSS mioblasti, cellule e Tripsinizzare come indicato al punto 1.1.
- Risospendere le cellule in 4 ml di mezzo completo.
- Utilizzando un emocitometro, contare le cellule per generare volumi contenenti 10 6 mioblasti. Pipettare volume in sterili microprovette 1,5 ml. Con una efficienza di trasfezione di ~ 10%, questi valori indicano che 100.000 luciferasi-esprimenti cellule sono rilevabili sullo scanner GE ExploreOptix dopo trapianto.
- Raggiungere un volume finale di iniezione di 15 microlitri, contenente 10 6 cellule C2C12. Se necessario, centrifugare microprovette a 2.000 rpm per un minuto. Aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta. Risospendere le cellule in 15 ml di HG-DMEM privo FBS.
5. Cella impianto
- Anestetizzare il mouse con il 2% isoflurano / 2% O 2. Pluck capelli dalla zona dorsale degli arti posteriori. Mantenere l'anestesia al 1,5% isoflurano / 2% O 2.
- Assicurarsi mioblasti C2C12 sono ben sospese. Con il mouse in posizione prona, estendere l'arto posteriore e utilizzare una siringa da insulina iniettare le cellule direttamente nella testa laterale del muscolo gastrocnemio con un angolo di 30 °. Iniettare mioblasti trasfettati nella parte posteriore destra e non trasfettate int mioblastio controlaterale (a sinistra) degli arti posteriori.
- Eseguire una scansione bioluminescenza di base: Trasferisci velocemente i mouse fase della scanner ottico, che il mouse in posizione prona. Collegare la linea di anestetico. Al fine di garantire il mouse rimane anestetizzato, una seconda persona dovrebbe essere presente per collegare la linea di anestetico, mentre gli altri posti l'animale nello scanner.
- Delicatamente estendere l'arto posteriore quindi la zona di iniezione è visibile. Arti posteriori nastro in posizione con un adesivo delicato come nastro medico.
- Chiudere la camera e garantire che nessuna luce può accedere all'interno dello scanner, in quanto ciò aumenterà il segnale di fondo rilevato. Lo scanner deve essere impostata su parametri inclusi nelle istruzioni del produttore per l'imaging bioluminescenza. In particolare, garantire la "non laser" sia selezionata.
- Disegnare una regione di interesse (ROI) intorno alla zona a pizzico e la scansione iniziale.
6. Iniezione di substrato Fluc, D-luciferina, nel topo mdx
<ol>7. BLI a Target Luc-esprimono PPM dopo l'impianto in modelli murini di DMD
- Dopo il periodo di assorbimento, anestetizzare mouse di nuovo, come descritto al punto 5.1.
- Trasferire il mouse sullo scanner ottico ed eseguire un'altra scansione bioluminescenza nello stesso modo della scansione sfondo.
- Anche se un periodo di 20 min assorbimento dovrebbe fornire la massima intensità del segnale, una successiva scansione può essere eseguita.
- Al termine di acquisizione delle immagini, sacrificare il mouse secondo le linee guida stabilite dal Comitato Etico Istituzionale degli animali e il Canadian Council on Animal Care (CCAC). Isolare dei muscoli degli arti posteriori e posto immediatamente in formalina al 10% per fissare per incastro paraffina. Eseguire la colorazione immunoistochimica per la luciferasi per confermare l'iniezione intramuscolare di mioblasti.
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Representative Results
Su 50-60% di confluenza, mioblasti C2C12 sono trasfettate con il suddetto gene reporter costrutto di fusione composta lucciola luciferasi [fluc], proteina fluorescente rossa monomerica [MRFP] SR39 e timidina chinasi [sr39tk] (Figura 1A). Efficienza di trasfezione è stata calcolata tramite microscopia a fluorescenza (figure 1B, C), facendo uso della sequenza MRFP nel nostro costrutto reporter. Sopravvivenza cellulare non è stata influenzata da etichettare con il substrato BLI, D-luciferina (Figura 1D). Seguendo trasfezione, circa 100.000 MRFP-esprimenti mioblasti sono state impiantate per via intramuscolare nel muscolo gastrocnemio di topi mdx (determinato in precedenza, manoscritto presentato); 100.000 cellule non trasfettate sono state similmente impiantato nella parte posteriore controlaterale come controllo. Impiantazione cella immediatamente seguente, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale (IP) con 150 mg / kg di D-luciferin. A seguito di un periodo di assorbimento di ~ 20 minuti, i topi sono stati ripresi su uno scanner piccolo animale ottico (GE ExplorOptix scatola nera che è attrezzato per bioluminescenza animali vivi e fluorescenza). Come precedentemente dimostrato, sia in vitro e post-impianto (manoscritto presentato) assorbimento di D-luciferina era specifica fluc-esprimenti mioblasti, senza bioluminescenza rilevabile in cellule non trasfettate (Figura 2). Immunoistochimica confermato trapianto di mioblasti intramuscolare (Figura 3)
Figura 1 Schema di reporter costrutto CMV-trifusion (A);. Campo chiaro / immagini di fluorescenza di mioblasti C2C12 trasfettate con il plasmide reporter di trifusion (B, C), saggio MTT per valutare la capacità di sopravvivenza delle cellule C2C12 dopo marcatura con substrato BLI, D-lucifer in (D).
Figura 2. Di imaging bioluminescenza (BLI). Una regione di interesse (ROI) è disegnato per racchiudere l'area colto dell'arto posteriore in cui sono iniettati mioblasti (A). Bioluminescenza non viene rilevato durante una scansione in background (B). A 23 minuti dopo l'iniezione di D-luciferina, un chiaro segnale viene rilevato a livello dell'arto posteriore destro dove sono iniettati luciferasi che esprimono i mioblasti. Nessun bioluminescenza viene rilevato dell'arto controlaterale posteriore iniettato con mioblasti non trasfettate (C). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 3. IHC utilizzando un anticorpo luciferasi di lucciola conferma impianto intramuscolare di transfettate cellule C2C12.
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Discussion
In questo studio, abbiamo descritto un veloce e affidabile imaging molecolare, approccio gene reporter in modo non invasivo mioblasti bersaglio / PPM dopo il trapianto. Mentre questo studio dimostra breve termine localizzazione PPM trapiantate tramite bioluminescense imaging (BLI), il modo in cui le cellule sono mirati possono, infatti, essere facilmente applicato ad una valutazione longitudinale di attecchimento delle cellule, attraverso l'impianto di cellule che esprimono stabilmente il gene reporter. A tal fine, il nostro gruppo ha generato linee di topi transgenici che ospitano il gene unificato reporter. Solo le cellule che esprimono il gene reporter ossidare D-luciferina per produrre fotoni per la visualizzazione con BLI. Poiché l'ossidazione del D-luciferina dipende genica, questo è un potente tecnologia con cui non invasivo immagine trapiantate cellule vitali. Il tessuto muscolare prelevato da questi topi transgenici e cellule satelliti (SC) isolato tramite FACS possono infatti essere targeted dopo l'impianto in topi mdx. Inoltre, è possibile monitorare il loro stato di differenziazione attraverso l'uso di un muscolo-specifico promotore, aumentando ulteriormente l'utilità e l'importanza delle tecnologie di imaging molecolare, come presentato qui, al campo della ricerca DMD (manoscritto presentato). In aggiunta alla sua rapidità e basso costo, BLI è atossico, rendendolo una scelta attraente per l'imaging frequente di piccoli animali. Questa caratteristica, così come la sua alta specificità, sarà prezioso per perfezionare le terapie di sostituzione mioblasti in modelli pre-clinici della malattia di Duchenne distrofia muscolare prima di passare a studi clinicamente applicabili riguardanti le tecnologie come il PET.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Sanjiv Gambhir per il dono del gene reporter fluc/mrfp/sr39tk. Questo lavoro è stato finanziato da The Stem Cell Network (SCN) del Canada, e della Fondazione Il Viaggio di Jesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
