Summary
A moyen non invasif pour évaluer le succès de la transplantation de myoblastes est décrite. La méthode tire parti d'un gène rapporteur de fusion unifié composé de gènes dont l'expression peut être visualisé avec différentes modalités d'imagerie. Ici, nous utilisons un
Abstract
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie grave maladie neuromusculaire héréditaire qui touche 1 personne sur 3.500 garçons, et est caractérisée par une dégénérescence progressive des muscles 1, 2. Chez les patients, la capacité des résidents cellules satellites du muscle (SC) pour régénérer fibres musculaires endommagées devient de plus en plus inefficace 4. Par conséquent, la transplantation de cellules souches musculaires (PPM) / myoblastes chez des sujets sains est une approche thérapeutique prometteuse pour la DMD. Une limitation majeure à l'utilisation de la thérapie de cellules souches, cependant, est le manque de technologies d'imagerie fiables pour suivi à long terme des cellules implantées, et pour en évaluer l'efficacité. Ici, nous décrivons un non-invasive et en temps réel approche pour évaluer le succès de la transplantation de myoblastes. Cette méthode tire parti d'un gène rapporteur de fusion unifié composé de gènes (la luciférase de luciole [fluctuations], la protéine fluorescente rouge monomère [RDRF] et SR39 thymidine kinase [sr39tk]) dont expression peut être visualisé avec différentes modalités d'imagerie 9, 10. Une variété de modalités d'imagerie, y compris par émission de positons (TEP), émission à photon unique tomographie (SPECT), imagerie par résonance magnétique (IRM), l'imagerie optique et haute fréquence 3D échographie sont maintenant disponibles, chacune avec des avantages et des limites 11. Bioluminescence d'imagerie (BLI) des études, par exemple, ont l'avantage d'être relativement peu coûteuse et à haut débit. C'est pour cette raison que, dans cette étude, nous nous servons de la luciférase de luciole (fluctuations) séquence du gène rapporteur contenue dans le gène de fusion et l'imagerie par bioluminescence (BLI) pour la localisation à court terme des myoblastes C2C12 viables suite à une implantation dans une souris modèle de la DMD (dystrophie musculaire sur le chromosome X [mdx] souris) 12-14. Surtout, BLI nous fournit un moyen d'examiner la cinétique de PPM étiquetés post-implantation, et sera utile pour suivre les cellules de façon répétée sur time et après la migration. Notre approche gène rapporteur permet en outre de nous de fusionner plusieurs modalités d'imagerie dans un unique sujet vivant; étant donné la nature tomographique, fine résolution spatiale et sa capacité à évoluer jusqu'à plus grands animaux et les humains 10,11, PET constituera la base des travaux futurs que nous suggèrent peut faciliter la traduction rapide des méthodes mises au point dans les cellules à des modèles précliniques et aux applications cliniques.
Protocol
1. Entretien et Propagation de myoblastes C2C12
- Plaque de myoblastes C2C12 dans un flacon de 75 cm2 et maintenir les cellules dans le sérum glucose à haute Dulbecco modifié Eagle (HG-DMEM) supplémenté avec du sérum de veau fœtal (SVF) à une concentration finale de 10%. Ne laissez pas les cellules à devenir confluentes, à tout moment, car cela appauvrissent la population myoblastique. Milieu doit être changé tous les autre billet journée:. Moyennes toujours chaude à 37 ° C dans un bain d'eau avant de l'utiliser.
- Lorsque les myoblastes à environ 80% de confluence, les cellules de passage à un nouveau flacon. Aspirer milieu de culture. Laver les cellules avec 4-5 ml solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pour éliminer toute trace de milieu de culture qui contient la trypsine-inhibiteur du sérum. Rincer brièvement la couche cellulaire avec 2-3 ml 0,25% (p / v) une solution de trypsine-EDTA pour dissocier les myoblastes adhérentes de la fiole. Aspirer la trypsine et la fiole dans l'étuve à 37 ° C pendant 5 min.
- Pendant cette incubationtion, de préparer un nouveau flacon de 9 ml de HG-DMEM/10% de FBS à moyen terme. Après trypsinisation, ajouter 10 ml de milieu complet pour cellules et pipettes 4-5 fois pour assurer la collecte de toutes les cellules dans le milieu. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans le ballon et incuber à nouveau 5% de CO 2 à 37 ° C.
2. Transfection des cellules C2C12
- Une fois que les cellules ont atteint 50% de confluence, transfecter selon les instructions du fabricant de Invitrogen. En bref, mélanger 90 ul de réactif Lipofectamine 2000 avec 4,5 ml d'OPTI-MEM moyenne. Dans un autre tube, mélanger 36 mg CMV-trifusion ADN du gène rapporteur avec 4,5 ml d'OPTI-MEM. Flick chaque tube de combiner et attendre 5 min. Mélanger le contenu des deux tubes, mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant trente minutes exactement. Remarque: Un second ballon devrait également être mis en place pour les cellules non transfectées qui ne reçoivent Lipofectamine et OPTI-MEM pour servir de témoin négatif.
- Retirer moyen de cellules C2C12 et ajouter 15,5ml de milieu frais HG-DMEM/10% de FBS. Ajouter milieu de transfection pour amener le volume total à 20 ml.
- Laisser les cellules à transfecter nuit pendant au moins 20 h à 37 ° C.
- Le lendemain, aspirer milieu de transfection et ajouter 10 ml HG-DMEM/10% de FBS.
- Voir les cellules sous un microscope inversé fluorescent. Capturer à la fois en champ clair et rouges des images de fluorescence (en utilisant un cube TRITC filtre; RDRF ex / em: 584/607 nm). Compter le nombre de cellules exprimant la DP-vues en fluorescence divisé par le nombre total de cellules vues sous un champ prometteur pour plusieurs champs de vision afin de générer efficacité de la transfection.
3. Évaluation de la cellule de survie / MTT Assay
- Un jour avant la transfection, plaque de 1x10 5 cellules C2C12 dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Les cellules doivent être étalées dans 500 volumes ul dans HG-DMEM/10% de FBS.
- Le lendemain, les myoblastes transfecter nuit comme décrit précédemment. Suivez les recommandations du fabricant pour la transfection Reagenvolumes t pour une plaque de 24 puits. Incuber un ensemble de puits avec Lipofectamine uniquement (pas d'ADN) comme témoin. Voir les cellules en fluorescence afin de s'assurer que la transfection adéquate s'est produite.
- Retirer milieu de transfection et de myoblastes incuber avec 5 mg / ml thiazolyle tétrazolium (MTT) en HG-DMEM/10% de FBS. Ajouter D-luciférine à huit des puits transfectées, et incuber à 37 ° C pendant quatre heures.
- Éliminer le milieu des puits. Solubiliser bleu cristaux de formazan en ajoutant 180 pl d'isopropanol à chaque puits. Agiter à 37 ° C pendant 15 min.
- En évitant toute solution de la pipette précipité, dans une plaque à 96 puits et lire l'absorbance à 575 nm.
4. Préparation de myoblastes pour transplantation
- Éliminer le milieu, laver avec du HBSS myoblastes, cellules et trypsiniser comme indiqué en 1.1.
- Remettre en suspension les cellules dans 4 ml de milieu complet.
- En utilisant un hémocytomètre, compter les cellules de générer des volumes contenant 10 6 myoblastes. Pipette volume dans des microtubes de 1,5 ml stériles. Avec une efficacité de transfection d'environ 10%, ces valeurs indiquent que 100.000 cellules exprimant la luciférase sont détectables sur le scanner GE ExploreOptix après la greffe.
- Atteindre un volume d'injection final de 15 ul, contenant 10 6 cellules C2C12. Si nécessaire, centrifuger microtubes à 2.000 tours par minute pendant une minute. Aspirer soigneusement le surnageant avec une pipette. Remettre en suspension les cellules dans 15 ul de DMEM dépourvu HG-FBS.
5. Implantation de cellules
- Anesthésier la souris avec 2% d'isoflurane / 2% O 2. Pluck les poils de la région dorsale des pattes postérieures. Maintenir l'anesthésie à l'isoflurane 1,5% / 2% O 2.
- Veiller à ce que myoblastes C2C12 sont bien suspendues. Avec la souris en position couchée, prolonger la patte arrière et utiliser une seringue à insuline à injecter des cellules directement dans le chef latéral du muscle gastrocnémien à un angle de 30 °. Injecter myoblastes transfectés dans le membre postérieur droit et non transfectées int myoblasteso le controlatérale (à gauche) des membres postérieurs.
- Effectuez un balayage bioluminescence de base: Transférez rapidement la souris à l'étape du scanner optique, la pose de la souris dans une position couchée. Branchez la ligne d'anesthésie. Pour garantir la souris reste anesthésié, une deuxième personne doit être présente pour brancher la ligne anesthésie tandis que les autres endroits de l'animal dans le scanner.
- Doucement prolonger la patte arrière de sorte que la zone d'injection est visible. Membres de bandes arrières en place avec un adhésif doux comme du ruban médical.
- Fermer la chambre et faire en sorte que la lumière ne peut accéder à l'intérieur du scanner, car cela augmente le signal d'arrière-plan détecté. Le scanner doit être réglé sur les paramètres inclus dans les instructions de votre fabricant pour l'imagerie par bioluminescence. En particulier, assurez-vous «pas de laser" est sélectionné.
- Dessinez une région d'intérêt (ROI) autour de la zone de balayage plumé et de départ.
6. L'injection de substrat Fluc, D-luciférine, en souris mdx
<ol>7. BLI à la cible Luc exprimant PPM Après l'implant dans les modèles murins de la DMD
- Après la période d'absorption, anesthésier la souris à nouveau, comme décrit au paragraphe 5.1.
- Transférer la souris vers le dispositif de balayage optique et d'effectuer un autre balayage bioluminescence de la même manière que le balayage de fond.
- Même si une période de 20 min absorption devrait fournir l'intensité du signal maximal, une analyse a posteriori peut être effectuée.
- A l'issue de l'acquisition d'image, sacrifiez la souris selon les lignes directrices établies par votre animal institutionnel du Comité d'éthique et le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Isoler les muscles des membres postérieurs et lieu immédiatement in formol à 10% de fixer pour l'encastrement de paraffine. Effectuer la coloration immunohistochimique pour la luciférase pour confirmer l'injection intramusculaire de myoblastes.
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Representative Results
À 50-60% de confluence, myoblastes C2C12 ont été transitoirement transfectées avec le gène de fusion susmentionné construction reporter composé de la luciférase de luciole [fluctuations], la protéine fluorescente rouge monomère [RDRF] et SR39 thymidine kinase [sr39tk] (figure 1A). L'efficacité de transfection a été calculé par microscopie à fluorescence (figures 1B, C), ce qui rend l'utilisation de la séquence RDRF dans notre construction de rapporteur. Survie cellulaire n'a pas été affectée par marquage avec le substrat BLI, D-luciférine (figure 1D). Après transfection, environ 100.000 RDRF exprimant myoblastes ont été implantés par voie intramusculaire dans le muscle gastrocnémien de souris mdx (déterminée précédemment, manuscrit soumis); 100.000 cellules non transfectées étaient également implanté dans le membre controlatéral arrière comme témoin. L'implantation des cellules Immédiatement après, les souris ont été injectés par voie intrapéritonéale (IP) de 150 mg / kg de D-luciferin. Après une période d'absorption d'environ 20 min, les souris ont été imagées sur un scanner optique du petit animal (GE ExplorOptix boîte noire qui est équipé de la bioluminescence et fluorescence des animaux vivants). Comme nous l'avons démontré, à la fois in vitro et post-implantatoire (manuscrit soumis) l'absorption de D-luciférine était spécifique à fluc-exprimant myoblastes, sans bioluminescence détectable dans les cellules non transfectées (figure 2). Immunohistochimie a confirmé la transplantation de myoblastes intramusculaire (figure 3)
Figure 1 Schéma du journaliste CMV-trifusion construction (A);. Clair / images de fluorescence des myoblastes C2C12 transfectées avec le plasmide rapporteur trifusion (B, C); test MTT pour évaluer la survie cellulaire C2C12 après marquage avec un substrat BLI, D-lucifer dans (D).
Figure 2. Imagerie par bioluminescence (BLI). Une région d'intérêt (ROI) est établi pour encadrer la zone membre arraché arrière où myoblastes sont injectés (A). Bioluminescence n'est pas détecté durant un balayage arrière-plan (B). À 23 min après l'injection de D-luciférine, un signal clair est détecté à partir du membre postérieur droit où la luciférase exprimant myoblastes sont injectés. Pas de bioluminescence est détecté dans le membre controlatéral injecté derrière avec des myoblastes non transfectées (C). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Figure 3. IHC en utilisant un anticorps luciférase de luciole confirme l'implantation intramusculaire de cellules C2C12 transfectées.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons décrit une rapide et fiable imagerie moléculaire, l'approche gène rapporteur de myoblastes cibles non invasive / PPM après la transplantation. Bien que cette étude démontre la localisation à court terme des pays partenaires méditerranéens transplantés via bioluminescense imagerie (BLI), la manière dont les cellules sont ciblées peuvent, en effet, être facilement appliquée à une évaluation longitudinale de la prise de greffe des cellules, grâce à l'implantation de cellules qui expriment de manière stable le gène rapporteur. À cette fin, notre groupe a généré des lignées de souris transgéniques qui hébergent le gène rapporteur unifiée. Seules les cellules exprimant le gène rapporteur oxyder D-luciférine pour produire des photons pour la visualisation à l'aide de BLI. Depuis oxydation du D-luciférine dépend de l'expression des gènes, c'est une technologie puissante avec laquelle non invasive d'image viables cellules transplantées. Le tissu musculaire récoltées à partir de ces souris transgéniques et des cellules satellites (SC) isolés par FACS peut en effet être targeted après l'implantation dans des souris mdx. En outre, nous pouvons suivre leur état de différenciation grâce à l'utilisation d'un promoteur spécifique du muscle, encore rehausser l'utilité et l'importance des technologies d'imagerie moléculaire, tels que présentés ici, dans le domaine de la recherche DMD (manuscrit soumis). En plus de sa rapidité et de faible coût, BLI est non-toxique, ce qui en fait un choix intéressant pour l'imagerie fréquente de petits animaux. Cette caractéristique, ainsi que sa grande spécificité, sera précieuse pour affiner les thérapies de remplacement de myoblastes dans des modèles pré-cliniques de maladie de la dystrophie musculaire de Duchenne avant de passer à des études cliniques impliquant des technologies applicables, tels que le PET.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Sanjiv Gambhir pour le don du gène rapporteur fluc/mrfp/sr39tk. Ce travail a été financé par le Réseau de cellules souches (RCS) du Canada et la Fondation Journey Le Jesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
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