Summary
En ikke-invasiv måde at evaluere succes myoblast transplantation er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af en samlet fusion reportergen bestående af gener, hvis ekspression kan afbildes med forskellige billeddannende modaliteter. Her vil vi gøre brug af en
Abstract
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en alvorlig genetisk neuromuskulær lidelse, der påvirker 1 på 3.500 drenge, og er kendetegnet ved progressiv muskel degeneration 1, 2. Hos patienter, bliver evnen til residente muskel satellit celler (SCS) at regenerere beskadigede myofibre stadig ineffektiv 4. Derfor transplantation af muskel progenitorceller (MPL) / myoblaster fra raske personer er en lovende terapeutisk tilgang til DMD. En væsentlig begrænsning i anvendelsen af stamcellebehandling er imidlertid en mangel på pålidelige billeddannende teknologier til langtidsovervågning af implanterede celler, og for at evaluere dens effektivitet. Her beskriver vi et ikke-indtrængende, real-time fremgangsmåde til at evaluere effekten af myoblast transplantation. Denne fremgangsmåde drager fordel af en samlet fusion reportergen bestående af gener (ildflue-luciferase [udsving], monomert rødt fluorescerende protein [mrfp] og sr39 thymidinkinase [sr39tk]), hvis expression kan afbildes med forskellige afbildningsmodaliteter 9, 10. En række forskellige billeddannende modaliteter, herunder positronemissionstomografi (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), optisk billeddannelse og højfrekvens 3D-ultralyd er nu tilgængelige, hver med unikke fordele og begrænsninger 11. Bioluminescens imaging (BLI) undersøgelser, for eksempel har den fordel, at relativt lave omkostninger og højt gennemløb. Det er af denne grund, at det i denne undersøgelse, har vi gør brug af ildflue-luciferase (udsving) reportergen sekvens indeholdt i fusionsgenet og bioluminescens billeddannelse (BLI) for den korte lokalisering af levedygtige C2C12 myoblaster efter implantation i en mus model for DMD (muskeldystrofi på X-kromosomet [MDX] mus) 12-14. Vigtigere, BLI giver os et middel til at undersøge kinetikken af mærkede Middelhavspartnerlandene post-implantation, og vil være nyttigt at spore celler gentagne gange over time og efterfølgende migration. Vores reporter gen tilgang yderligere giver os mulighed for at flette flere billeddiagnostiske metoder i en enkelt levende emne; givet tomografisk natur, fine rumlige opløsning og evne til at skalere op til større dyr og mennesker 10,11, vil PET danner grundlag for det fremtidige arbejde, som vi antyder kan lette hurtig translation af metoder udviklet i celler til prækliniske modeller og kliniske anvendelser.
Protocol
1. Opretholdelse og formering af C2C12 myoblaster
- Plade C2C12 myoblaster i en 75 cm2 kolbe og opretholde celler i højglucose Dulbeccos modificerede Eagles Serum (HG-DMEM) suppleret med føtalt bovint serum (FBS) til en slutkoncentration på 10%. Lad ikke celler til at blive sammenflydende til enhver tid, da dette vil nedbryder myoblastic befolkning. Medium ændres hver anden dag Note:. Altid varmt medium til 37 ° C i et vandbad inden anvendelse.
- Når myoblaster bliver omtrent 80% konfluente, passage-celler til en ny kolbe. Sug dyrkningsmedium. Vask cellerne med 4-5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) for at fjerne alle spor af dyrkningsmedium, der indeholder trypsin-hæmmende serum. Kortvarigt skyl cellelaget med 2-3 ml 0,25% (vægt / volumen) trypsin-EDTA-opløsning til at dissociere de adhærerende myoblaster fra kolben. Aspirere trypsin og sted kolbe i inkubator ved 37 ° C i 5 min.
- Under denne INCUBAtion, forberede en ny kolbe med 9 ml HG-DMEM/10% FBS medium. Efter trypsinisering, der tilsættes 10 ml komplet medium til celler og pipette 4-5 gange for at sikre indsamlingen af alle celler i mediet. Der tilsættes 1 ml cellesuspension til den nye kolbe og inkubér i 5% CO2 ved 37 ° C.
2. C2C12 celletransfektion
- Når cellerne har nået 50% konfluens, transficere ifølge producentens instruktioner fra Invitrogen. Kort fortalt kombineres 90 pi Lipofectamine 2000 reagens med 4,5 ml OPTI-MEM-medium. I et andet rør, kombinere 36 ug CMV-trifusion reportergen-DNA med 4,5 ml OPTI-MEM. Svirp hvert rør til at kombinere og vente 5 min. Kombinere indholdet af de to rør, blandes forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i nøjagtig 30 minutter Bemærk:. En anden kolbe bør også sat op til utransficerede celler, som kun modtager Lipofectamin og OPTI-MEM til at tjene som en negativ kontrol.
- Fjern mediet fra C2C12-celler, og der tilsættes 15,5ml frisk HG-DMEM/10% FBS-medium. Tilføj transfektion medium til at bringe den samlede volumen til 20 ml.
- Tillade celler at transficere natten over i mindst 20 timer ved 37 ° C.
- Næste dag, aspirere transfektion medium og tilsæt 10 ml HG-DMEM/10% FBS.
- Vis celler under et omvendt fluorescerende mikroskop. Capture både lyse felt og rød fluorescens billeder (ved hjælp af en TRITC filter terning, mrfp ex / em: 584/607 nm). Tæl antallet af RFP-udtrykkende celler set under fluorescens divideret med det samlede antal celler set under lyse felt for flere synsfelter at generere transfektionseffektivitet.
3. Vurdering af Cell Overlevelsesevne / MTT Assay
- En dag før transfektion, plade 1x10 5 C2C12 celler til hver brønd i en plade med 24 brønde. Celler bør udplades i 500 pi volumener i HG-DMEM/10% FBS.
- Næste dag, transficere myoblaster natten over som tidligere beskrevet. Følg producentens forslag til transfektion reagenst mængder for en 24-brønds plade. Inkuber et sæt brønde med lipofectamin alene (intet DNA) som kontrol. Vis celler under fluorescens at sikre, at korrekt transfektion er sket.
- Fjern transfektion medium og inkuber myoblaster med 5 mg / ml thiazolyl blue tetrazolium (MTT) i HG-DMEM/10% FBS. Tilføj D-luciferin til otte af de transficerede brønde, og inkuber ved 37 ° C i fire timer.
- Fjern mediet fra brøndene. Solubilisere blå formazankrystaller ved tilsætning af 180 pi isopropanol til hver brønd. Omrystes ved 37 ° C i 15 minutter.
- Undgå bundfald, pipette opløsningen i en 96-brønds plade, og absorbansen aflæses ved 575 nm.
4. Fremstilling af myoblaster til Transplant
- Fjern mediet, vask myoblaster med HBSS, og Trypsinisér cellerne som beskrevet i 1.1.
- Resuspendere celler i 4 ml komplet medium.
- Anvendelse af et hæmocytometer, cellerne tælles for at generere volumener indeholdende 10 6 myoblaster. Pipette vol.ume i sterile 1,5 ml mikrorør. Med en transfektionseffektivitet på ~ 10%, viser disse værdier, at 100.000 luciferase-udtrykkende celler kan påvises på GE ExploreOptix scanner efter transplantation.
- Opnå et slutvolumen til injektion af 15 pi indeholdende 10 6 C2C12-celler. Om nødvendigt centrifugeres mikrorør ved 2.000 omdrejninger i minuttet i et minut. Forsigtigt sug supernatanten med en pipette. Resuspendere celler i 15 pi HG-DMEM uden FBS.
5. Cell Implantation
- Bedøve mus med 2% isofluran / 2% O2. Plukke hår fra den dorsale bagbenet område. Opretholde anæstesi med 1,5% isofluran / 2% O2.
- Sørg C2C12 myoblaster er godt suspenderet. Med musen i liggende stilling, forlænge bagbenet og anvende en insulinsprøjte at injicere celler direkte ind i den laterale hoved musculus gastrocnemius i en 30 ° vinkel. Indsprøjtes transficerede myoblaster i højre bagben og transficerede myoblaster into kontralaterale (venstre) bagben.
- Udfør en baseline bioluminescens scanning: Hurtig overførsel af musen til fase i den optisk scanner, om musen i en udsat position. Tilslutte den anæstetiske linje. For at sikre musen forbliver bedøvet, skal en anden person være til stede for at tilslutte den bedøvende linje mens de andre steder dyret i scanneren.
- Forsigtigt forlænge bagbenet, så området med injektionen er synlig. Tape bagben på plads med en blid klæbemiddel såsom medicinsk tape.
- Kammeret lukkes og sikre, at intet lys kan få adgang til det indre af scanneren, da dette vil gøre baggrunden detekterede signal. Scanneren skal indstilles til parametre, der indgår i din fabrikantens anvisninger for bioluminescens billeddannelse. Konkret sikre "ingen laser" er valgt.
- Tegn en region af interesse (ROI) omkring plukkede område og start scanning.
6. Injektion af Fluc Substrat, D-luciferin, i Mdx Mouse
<ol>7. BLI til Target Luc-udtrykkende Middelhavspartnerlandene Efter Implant i musemodeller af DMD
- Efter optagelsesperioden, bedøve musen igen, som beskrevet i 5.1.
- Overfør musen tilbage til den optisk scanner og opfylde en anden bioluminescens scanning på samme måde som baggrunden scanning.
- Skønt en 20 min optagelse bør tjene maksimal signalintensitet, kan en efterfølgende scanning skal udføres.
- Ved afslutningen af billedet erhvervelse, ofrer musen i henhold til retningslinjer fastsat af din Institutional Animal etiske komité, og den canadiske Råd om Animal Care (CCAC). Isoler bagben muskel og umiddelbart in 10% formalin til at fastsætte for paraffin nedstøbning. Udføre immunhistokemiske farvning for luciferase for at bekræfte intramuskulær injektion af myoblaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved 50-60% konfluens blev C2C12 myoblaster transient transficeret med det ovennævnte fusionsprotein reportergenkonstruktionen sammensat af ildflue-luciferase [udsving], monomert rødt fluorescerende protein [mrfp] og sr39 thymidinkinase [sr39tk] (figur 1A). Transfektionseffektivitet blev beregnet via fluorescensmikroskopi (fig. 1B, C), der gør brug af mrfp sekvensen i vores reporterkonstruktion. Cell overlevelsesevne blev ikke påvirket af mærkning med BLI substratet, D-luciferin (figur 1D). Efter transfektion blev omkring 100.000 mrfp-udtrykkende myoblaster implanteret intramuskulært i musculus gastrocnemius hos mdx-mus (bestemt tidligere, manuskript indsendt) 100000 utransficerede celler blev tilsvarende implanteret i den kontralaterale bagbenet som kontrol. Umiddelbart efter cell implantation blev mus injiceret intraperitonealt (IP) med 150 mg / kg D-luciferin. Efter en optagelse periode på ~ 20 min, blev mus afbildet på et lille dyr optisk scanner (GE ExplorOptix sorte boks, der er udstyret til levende dyr bioluminescens og fluorescens). Som tidligere demonstreret, både in vitro og efter implantation (manuskript indsendt) optagelse af D-luciferin var specifik for udsving udtrykkende myoblaster, uden nogen påviselig bioluminescens i utransficerede celler (figur 2). Immunhistokemi bekræftede, intramuskulær transplantation af myoblaster (fig. 3)
Figur 1 Diagram af CMV-trifusion reporterkonstruktion (A). Brightfield / fluorescensbilleder af C2C12 myoblaster transficeret med trifusion reporterplasmidet (B, C), MTT-assay til vurdering C2C12 celler overlevelsesevne efter mærkning med BLI substrat, D-lucifer i (D).
Figur 2. Bioluminescens imaging (BLI). En region af interesse (ROI) trækkes at omslutte plukkede bagbenet område, hvor myoblaster injiceres (A). Bioluminescence ikke findes under en baggrund scanning (B). Ved 23 min efter injektion af D-luciferin, er et klart signal opdaget fra højre bagben hvor luciferase-udtrykkende myoblaster injiceres. Ingen bioluminescens detekteres i den kontralaterale bagben injiceret med utransficerede myoblaster (C). Klik her for at se større figur .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
Figur 3. IHC anvendelse af et ildflue-luciferase-antistof bekræfter intramuskulær implantation af transficerede C2C12-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse har vi beskrevet en hurtig og pålidelig molekylær billeddannelse, reportergen tilgang til ikke-invasivt target myoblaster / Middelhavspartnerlandene efter transplantation. Selv om denne undersøgelse viser den korte lokalisering af transplanterede Middelhavspartnerlandene via bioluminescense imaging (BLI), den måde, hvorpå celler målrettes kan faktisk let anvendes til en langsgående vurdering af celle-transplantation, ved implantation af celler, der stabilt udtrykker reportergenet. Til dette formål har vores gruppe frembragt transgene mus linjer, der huser den forenede reportergen. Kun celler, der udtrykker reportergenet oxidere D-luciferin til fremstilling fotoner til visualisering ved hjælp BLI. Eftersom oxidation af D-luciferin er afhængig genekspression, er en kraftig teknologi, som til ikke-invasivt billede levedygtige transplanterede celler. Muskelvæv høstet fra disse transgene mus og satellit celler (SCS) isoleret via FACS kan faktisk være targeted efter implantation i mdx-mus. Derudover kan man spore deres differentieringsstatusen ved anvendelse af en muskel-specifik promotor, yderligere hvilket øger nytten og betydningen af molekylær billeddannelse teknologier, såsom præsenteret heri, til området for DMD forskning (manuskript indsendt). Ud over dens hurtighed og lave omkostninger, er BLI ikke-toksisk, hvilket gør det attraktiv for hyppig billeddannelse af små dyr. Denne funktion, samt dens høje specificitet, vil være uvurderlig i raffinering myoblast udskiftning behandlingsformer i prækliniske sygdomsmodeller af Duchennes muskeldystrofi før videre til klinisk relevante undersøgelser af teknologier såsom PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Sanjiv Gambhir for den gave af fluc/mrfp/sr39tk reportergenet. Dette arbejde blev finansieret af The Stem Cell Network (SCN) i Canada, og The Jesse Journey Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
