Summary
筋芽細胞移植の成功を評価するための非侵襲的な手段が記載されている。この方法は、その発現が異なる撮像モダリティで撮影することができる遺伝子を統合的融合レポーター遺伝子を利用しています。ここでは、利用すること
Abstract
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は3500男子 で1に影響を及ぼす重篤な遺伝性神経筋疾患であり、進行性筋変性1,2によって特徴づけられる。患者では、損傷した筋線維を再生させる常駐筋衛星細胞の能力（SCS）は4ますます効率が悪くなる。したがって、健常者の筋前駆細胞（MPCは）/筋芽細胞の移植は、DMDに対する有望な治療アプローチである。幹細胞療法の使用への主要な制限は、しかし、移植細胞の長期的なモニタリングのため、その有効性を評価するための信頼性の高い画像処理技術の欠如である。ここでは、筋芽細胞移植の成功を評価するための非侵襲、リアルタイムのアプローチについて説明します。この方法は、（ホタルルシフェラーゼ[fluc]、単量体赤色蛍光タンパク質[MRFP]とSR39チミジンキナーゼ[sr39tk]）expre遺伝子から成る統一融合レポーター遺伝子を利用していますssionは異なる撮像モダリティ9、10に結像させることができる。陽電子放射断層撮影（PET）、単光子放出コンピュータ断層撮影（SPECT）、磁気共鳴イメージング（MRI）、光学イメージング、および高周波3次元超音波を含むイメージングモダリティ、様々なユニークな長所、短所がそれぞれ、利用可能になりました11。生物発光イメージング（BLI）の研究では、例えば、比較的低コスト、高スループットであるという利点を持っています。これは、本研究では、我々はマウスに移植後の生存能力のあるC2C12筋芽細胞の短期のローカリゼーションのための融合遺伝子と生物発光イメージング（BLI）内に含まれるホタルルシフェラーゼ（fluc）レポーター遺伝子配列を利用して、このような理由からですDMDのモデル12-14（X染色体[MDX]マウスの筋ジストロフィー）。重要なのは、BLIは、標識されたMPCは、移植後の体内動態を検討するための手段を提供してくれますし、tで繰り返し細胞を追跡するために有用であろうIMEとは、次の移行。私たちのレポーター遺伝子アプローチはさらに、私たちは、単一の生体内で複数の画像診断法をマージすることができ、断層の性質、空間分解能と大きな動物とヒト10,11にスケールアップする能力を考えると、PETは、私たちが将来の仕事の基礎を形成します前臨床モデルへと臨床応用への細胞内で開発された方法の迅速な翻訳を促進することが示唆された。
Protocol
1。 C2C12筋芽細胞の維持と伝播
- プレート75cm 2フラスコでC2C12筋芽細胞および10％の最終濃度になるようにウシ胎児血清（FBS）を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル血清（HG-DMEM）中で細胞を維持。これは筋芽細胞の人口を激減させるように細胞がいつでもコンフルエントになることを許可しないようにしてください。媒体は、隔日に変更する必要があります注：常に暖かい培地を37℃にして、使用する前に水浴のC。
- 筋芽細胞が約80％コンフルエントになったときに、新しいフラスコに継代細胞。培地を吸引します。トリプシン阻害血清を含む培地のすべてのトレースを削除する4〜5ミリリットルハンクス平衡塩溶液（HBSS）で細胞を洗浄します。簡単に言えば2〜3ミリリットル0.25％（w / v）のフラスコから付着筋芽細胞を解離するトリプシン-EDTA溶液で細胞層を洗浄してください。 5分間37℃でインキュベーター内でトリプシンと場所フラスコを吸引します。
- このインキュベーション中にるには、HG-DMEM/10％FBS培地9mlの持つ新しいフラスコを準備します。トリプシン処理後、培地内のすべてのセルのコレクションを確実にするために細胞やピペット4-5回に完全培地10 mlを加える。新しいフラスコに細胞懸濁液1 mlを加え、37℃、5％CO 2中でインキュベート℃、
2。 C2C12細胞トランスフェクション
- 一度細胞がコンフルエントに50％に達しており、Invitrogenからメーカーの指示に従ってトランスフェクション。簡単に言えば、4.5ミリリットルのOPTI-MEM培地で90μlのリポフェクタミン2000試薬を組み合わせています。別のチューブに、4.5ミリリットルのOPTI-MEMで36μgのCMV-trifusionレポーター遺伝子DNAを兼ね備えています。各チューブは5分を組み合わせて、待つことにフリックします。穏やかに混合し、正確に30分間室温でインキュベートし、両方のチューブの内容を結合注：第二のフラスコものみリポフェクタミンおよびOPTI-MEMはネガティブコントロールとして機能するように、受信トランスフェクトしていないセルに対して設定する必要があります。
- C2C12細胞から培地を除去し、15.5を追加新鮮HG-DMEM/10％FBS培地1ml。 20mlの総容積を持って来るために、トランスフェクション培地を追加します。
- 細胞は37℃で少なくとも20時間一晩トランスフェクトすることができ℃、
- 翌日、トランスフェクション培地を吸引し、10ミリリットルHG-DMEM/10％FBSを追加します。
- 倒立蛍光顕微鏡下で細胞を見る。明視野および赤色蛍光画像（; 607分の584 nmのMRFP元/全角TRITCフィルターキューブを使用）の両方をキャプチャします。トランスフェクション効率を生成するために、ビューの複数のフィールドの明るいフィールドの下で見た細胞の総数で割った蛍光下で観察し、RFPを発現している細胞の数をカウントします。
3。細胞生存/ MTTアッセイの評価
- 24ウェルプレートでのトランスフェクションは、プレートの各ウェルに1×10 5 C2C12細胞の前に一日。細胞はHG-DMEM/10％FBS中500μlの体積に播種する必要があります。
- 翌日、前述のように一晩トランスフェ芽。トランスフェクションreagenについては、メーカーの提案に従う24ウェルプレート用のトンボリューム。コントロールとしてのみリポフェクタミン（DNAなし）で井戸のセットをインキュベートする。その適切なトランスフェクションが行われたことを確認するために蛍光で細胞を見る。
- HG-DMEM/10％FBS中5 mg / mlのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（MTT）を用いてトランスフェクション培地でインキュベート筋芽細胞を取り除きます。トランスフェクトされた井戸の8にD-ルシフェリンを追加し、4時間37℃でインキュベートする。
- 井戸からメディアを取り出します。各ウェルに180μlのイソプロパノールを添加することにより、青色ホルマザン結晶を可溶化する。 15分間37℃で振とうする。
- 96ウェルプレートに沈殿物、ピペット溶液の回避および575 nmの吸光度を読み取る。
4。移植のための筋芽細胞の調製
- 、培地を除去HBSSで筋芽細胞を洗浄し、1.1で説明したように、細胞をトリプシン処理。
- 完全培地4mlに細胞を再懸濁する。
- 血球計を使用して、10 6芽細胞を含むボリュームを生成する細胞を数える。ピペットVOL滅菌済みの1.5mlマイクロチューブに梅。 〜10％のトランスフェクション効率と、これらの値は、100,000ルシフェラーゼ発現細胞は、移植後のGE ExploreOptixスキャナで検出可能であることを示している。
- 10 6 C2C12細胞を含む、15μlの最終噴射量を達成する。必要であれば、1分間2,000 rpmでマイクロチューブを遠心します。ピペットで注意深く上清を吸引します。 HG-DMEMにFBSを欠く15μlの中に細胞を再懸濁する。
5。細胞移植
- イソフルラン2パーセント/ 2％O 2でマウスを麻酔。背側後肢エリアから毛をむしる。イソフルラン1.5パーセント/ 2％のO 2で麻酔を維持します。
- C2C12筋芽細胞をよく懸濁していることを確認します。腹臥位でマウスを使って、後肢を拡張し、30°の角度で腓腹筋の外側頭に直接細胞を注入するためにインスリン注射器を使用しています。右後肢とトランスフェクトしていない筋芽細胞のintにトランスフェクトされた筋芽細胞を注入対側（左）後肢をO。
- ベースライン生物発光スキャンを実行：すばやく腹臥位でマウスを敷設、光スキャナのステージにマウスを移す。麻酔ラインをフックアップ。マウスを確保するために麻酔をかけたまま、二人目は、スキャナの他の場所の動物の間に麻酔ラインをフックするために存在している必要があります。
- 注射の面積が表示されるように優しく後肢を拡張します。そのような医療用テープなど優しい接着剤のある場所でテープ後肢。
- これが検出されたバックグラウンド信号を増加させるように、チャンバーを閉じて、光がスキャナ内部にアクセスすることはできませんことを確認してください。スキャナは、生物発光イメージングについては、製造元の指示に含まれるパラメータに設定する必要があります。具体的には、 "全くレーザー"が選択されていないことを確認してください。
- 羽をむしられた領域の周囲に関心領域（ROI）を描き、スキャンを開始します。
6。 Fluc基質の注入、mdxマウスにD-ルシフェリン、
<OL>7。 DMDのマウスモデルにインプラントを次のターゲットリュック発現のMPCへのBLI
- 5.1で説明されるように摂取期間の後、再びマウスを麻酔。
- 光学スキャナに戻ってマウスを転送し、バックグラウンドでのスキャンと同様に別の生物発光スキャンを実行します。
- 20分取込期間が最大信号強度を提供する必要がありますが、その後のスキャンを実行することができる。
- 画像収集が完了すると、施設内動物倫理委員会及びアニマル·ケアに関するカナダ評議会（CCAC）によって設定されたガイドラインに沿ってマウスを生け贄に捧げる。私はすぐに後肢の筋肉や場所を隔離パラフィン包埋のために修正するためにnを10％ホルマリン。筋芽細胞の筋肉内注射を確認するルシフェラーゼの免疫組織化学染色を行います。
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Representative Results
50から60パーセントコンフルエント時に、C2C12筋芽細胞を一過上記融合レポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼ成る構築物でトランスフェクトした[fluc]、単量体の赤色蛍光タンパク質[MRFP]とSR39チミジンキナーゼ[sr39tk]（ 図1A）。トランスフェクション効率を構築する私たちのレポーターにMRFPシーケンスを利用して、蛍光顕微鏡（ 図1B、C）を介して算出した。細胞の生存性は、BLIの基板、D-ルシフェリン（ 図1D）で標識することにより影響を受けなかった。トランスフェクション後、約100,000 MRFP発現筋芽細胞をmdxマウスの腓腹筋（以前、原稿が提出され決定される）に筋肉内に移植した。10万トランスフェクトしていない細胞が同様に反対側の制御として後肢に移植した。直ちに細胞移植後、マウスは150 mg / kgのD-lucifeを腹腔内（IP）注射したRIN。 〜20分の取り込み期間後、マウスは小動物光学スキャナ（生きた動物の生物発光と蛍光のために装備され、GE ExplorOptixブラックボックス）に結像された。以前に示したように、D-ルシフェリンの取り込みvitroおよび移植後の両方で （原稿提出）は、非トランスフェクト細胞では検出されなかっ生物発光（ 図2）、fluc発現筋芽細胞に特異的であった。免疫組織化学は、筋芽細胞の筋肉内移植（ 図3）を確認
図1は 、CMV-trifusionレポーターコンストラクト（）の概略;明/プラスミドtrifusionレポーター（A、B、C）を用いてトランスフェクトしたC2C12筋芽細胞の蛍光画像;のBLI基板、D-ルシファーで標識後にC2C12細胞の生存性を評価するために、MTTアッセイ （D）インチ
図2。生物発光イメージング（BLI）は 、関心領域（ROI）は、筋芽細胞（）が注入され、羽をむしられた後肢領域を囲むように描かれている。生物発光は、バックグラウンドスキャン（B）の中に検出されなかった。 D-ルシフェリンの注射後23分で、明確なシグナルは、ルシフェラーゼ発現芽細胞が注入され、右後肢から検出されています。いいえ生物発光は、トランスフェクトされていない筋芽細胞（C）を注射し、対側後肢で検出されていません。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図3。ホタルルシフェラーゼ抗体を用いたIHCは、トランスフェクトしたC2C12細胞の筋肉内注入が確認された。
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Discussion
そこで本研究では、移植後の非侵襲的に標的筋芽細胞/ MPCのための高速かつ信頼性の高い分子イメージング、レポーター遺伝子アプローチを説明してきました。この研究はbioluminescenseイメージング（BLI）を介して移植されたMPCの短期的な局在を示しているが、細胞が標的とされる方法は 、実際には、簡単に安定して発現していることが細胞の移植による細胞移植の長期的評価に適用することができますレポーター遺伝子。この目的を達成するために、当社グループは、統一されたレポーター遺伝子を抱いているトランスジェニックマウス系統を生成しています。レポーター遺伝子を発現する細胞のみがBLIを使って可視化のための光子を生成するためにD-ルシフェリンを酸化させる。 D-ルシフェリンの酸化は、遺伝子発現に依存しているので、これは、非侵襲的に画像生存可能な移植細胞へと強力な技術です。 FACSにより単離し、これらのトランスジェニックマウスと衛星細胞（SCS）から収穫された筋肉組織は確かtargeteすることができますmdxマウスに移植後、D。さらに、我々はさらに、DMDの研究分野（原稿提出）に、本明細書で提示など、分子イメージング技術の有用性と重要性を高め、筋肉特異的プロモーターの使用により、その分化状態を追跡することができます。その迅速かつ低コストに加えて、BLIのは小動物の頻繁なイメージングのための魅力的な選択肢となって、非毒性である。この機能だけでなく、その高い特異性は、PETなどの技術を含む臨床的に適用可能な研究に進む前にデュシェンヌ型筋ジストロフィーの前臨床疾患モデルにおける筋芽細胞補充療法を精製に大いに役立つだろう。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
著者はfluc/mrfp/sr39tkレポーター遺伝子の贈り物をSanjivガンビールに感謝したいと思います。この作品は、カナダの幹細胞ネットワーク（SCN）とジェシーの旅財団によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
