Summary
Um meio não-invasivo para avaliar o sucesso do transplante de mioblastos é descrito. O método leva vantagem de um gene de fusão unificada repórter composto de genes cuja expressão pode ser trabalhada com diferentes modalidades de imagem. Aqui, fazemos uso de um
Abstract
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética grave neuromuscular que afeta 1 em cada 3.500 meninos, e é caracterizada por degeneração muscular progressiva 1, 2. Em pacientes, a capacidade das células satélites do músculo residentes (SCs) para regenerar miofibras danificadas torna-se cada vez menos eficaz 4. Assim, o transplante de células progenitoras musculares (PPM) / mioblastos de indivíduos saudáveis é uma abordagem terapêutica promissora para DMD. Um grande limitação para a utilização da terapia de células-tronco, contudo, é uma falta de tecnologias de imagem fiáveis para acompanhamento a longo prazo das células implantadas, e para avaliar a sua eficácia. Aqui, nós descrevemos um método não invasivo, a abordagem em tempo real, para avaliar o sucesso do transplante de mioblastos. Este método tira vantagem de um gene repórter unificado de fusão composta de genes (a luciferase do pirilampo [flutuações], proteína fluorescente vermelha monomérica [MRFP] e SR39 timidina-quinase [sr39tk]) Expre cujossion pode ser trabalhada com diferentes modalidades de imagem 9, 10. Uma variedade de métodos de imagem, incluindo tomografia por emissão de pósitrons (PET), emissão de fóton único tomografia computadorizada (SPECT), ressonância magnética (MRI), de imagem óptica, e alta freqüência 3D ultra-som já estão disponíveis, cada um com suas vantagens e limitações 11. Bioluminescência de imagem (BLI) estudos, por exemplo, têm a vantagem de ser de custo relativamente baixo e de alto rendimento. É por este motivo que, no presente estudo, que fazem uso da luciferase do pirilampo sequência do gene (flutuações) repórter contido dentro do gene de fusão e de imagem de bioluminescência (BLI) para a localização de curto prazo de mioblastos C2C12 viáveis após a implantação num ratinho modelo de DMD (distrofia muscular no cromossomo X [mdx] mouse) 12-14. Importante, BLI nos fornece um meio para analisar a cinética de PPM rotulados pós-implantação, e vai ser útil para rastrear células repetidamente sobre tIME e migração seguinte. Nossa abordagem de gene repórter ainda nos permite mesclar várias modalidades de imagem em um único sujeito vivo, dada a natureza tomográficos, resolução espacial fina e capacidade de escalar até animais maiores e os seres humanos 10,11, PET irá formar a base do trabalho futuro que sugerem podem facilitar a tradução rápida dos métodos desenvolvidos nas células a modelos pré-clínicos e para aplicações clínicas.
Protocol
1. Manutenção e propagação de mioblastos C2C12
- Placa mioblastos C2C12 em um frasco de 75 cm 2, e manter as células em soro Modificado por Dulbecco de alta glucose de Eagle (DMEM-HG), suplementado com soro bovino fetal (FBS) a uma concentração final de 10%. Não permitir que as células se tornam confluentes, a qualquer momento, pois isso irá esgotar a população mioblásticas. Meio deverá ser trocado a cada outro dia Nota:. Meio sempre quente a 37 ° C num banho de água antes da sua utilização.
- Quando mioblastos tornar cerca de 80% confluentes, as células de passagem para um novo frasco. Aspirar o meio de cultura. Lavar as células com 4-5 ml de Solução de Sal Equilibrada de Hanks (HBSS), para remover todos os vestígios de meio de cultura, que contém inibidor de tripsina de soro. Resumidamente lavar a camada de células com 2-3 ml de 0,25% (w / v) de solução de tripsina-EDTA para dissociar os mioblastos aderentes provenientes do frasco. Aspirar tripsina e balão lugar em estufa a 37 ° C durante 5 min.
- Durante esta incubaçãoção, preparar um novo frasco com 9 ml de HG-DMEM/10% FBS. Após tripsinização, adicionam-se 10 ml de meio completo para células e tempos de pipeta 4-5 para garantir a recolha de todas as células no meio. Adicionar 1 ml de suspensão de células para o balão de novo e incubar em 5% de CO2 a 37 ° C.
2. A transfecção celular C2C12
- Uma vez que as células atingiram 50% de confluência, transfectar de acordo com as instruções do fabricante a partir de Invitrogen. Resumidamente, combinar 90 ul de reagente Lipofectamine 2000 com 4,5 ml de meio OPTI-MEM. Em outro tubo, combinar 36 ug trifusion CMV-DNA do gene repórter com 4,5 ml OPTI-MEM. Flick cada tubo para combinar e esperar 5 min. Combinar o conteúdo de ambos os tubos, misturar gentilmente e incubar à temperatura ambiente durante exactamente 30 minutos Nota:. Um segundo frasco deve também ser configurado para células não transfectadas que apenas recebem Lipofectamine e OPTI-MEM para servir como um controlo negativo.
- Remover meio de células C2C12 e adicionar 15,5ml de fresco HG-DMEM/10 FBS%. Adicionar meio de transfecção para levar o volume total a 20 ml.
- Permitir que as células durante a noite para transfectar pelo menos durante 20 horas a 37 ° C.
- No dia seguinte, aspirar meio de transfecção e juntar 10 ml HG-DMEM/10% de FBS.
- Ver células em um microscópio invertido fluorescente. Capture o campo claro e vermelho imagens de fluorescência (usando um cubo TRITC filtro; MRFP ex / em: 584/607 nm). Contar o número de células que expressam RFP visualizados sob fluorescência dividido pelo número total de células vistas sob campo brilhante para múltiplos campos de visão para gerar a eficiência da transfecção.
3. Avaliação da sobrevivência celular Ensaio / MTT
- Um dia antes da transfecção, placa de 1x10 5 células C2C12 em cada poço de uma placa de 24 poços. As células devem ser plaqueadas em 500 uL volumes de HG-DMEM/10% de FBS.
- No dia seguinte, os mioblastos transfectam durante a noite, como descrito anteriormente. Siga as sugestões do fabricante para transfecção Reagenvolumes de t para uma placa de 24 poços. Incubar de um conjunto de poços com Lipofectamine apenas (sem ADN) como um controlo. Ver células sob fluorescência para assegurar que a transfecção apropriada ocorreu.
- Remover meio de transfecção e mioblastos incubar com 5 mg / ml tiazolil azul de tetrazólio (MTT) em HG-DMEM/10% de FBS. Adicionar D-luciferina a oito dos poços transfectadas, e incubar a 37 ° C durante quatro horas.
- Remover meio de poços. Solubilizar os cristais de formazan azuis, adicionando 180 ul de isopropanol a cada poço. Agitar a 37 ° C durante 15 min.
- Evitando qualquer precipitado solução pipeta, em uma placa de 96 poços e ler a absorvância a 575 nm.
4. Preparação de Mioblastos para transplante
- Remover meio, lavar mioblastos com HBSS, e Tripsinizar as células como descrito em 1.1.
- Re-suspender as células em 4 ml de meio completo.
- Usando um hemocitómetro, contagem de células para gerar volumes contendo 10 6 mioblastos. Pipeta volume em microtubos estéreis 1,5 ml. Com uma eficiência de transfecção de ~ 10%, estes valores indicam que 100.000 células que expressam luciferase são detectáveis no scanner ExploreOptix GE após o transplante.
- Atingir um volume final de injecção de 15 uL, contendo 10 6 células C2C12. Se necessário, centrifugar microtubos em 2000 rpm durante um minuto. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Re-suspender as células em 15 ul de HG-DMEM sem FBS.
5. O implante de células
- Anestesiar rato com isoflurano a 2% / 2% O 2. Arrancar pêlos da região dorsal do membro posterior. Manter a anestesia com 1,5% de isoflurano / O 2 a 2%.
- Assegurar mioblastos C2C12 são bem suspensa. Com o mouse em uma posição de bruços, estender o membro posterior e usar uma seringa de insulina para injetar células diretamente na cabeça lateral do músculo gastrocnêmio em um ângulo de 30 °. Injectar mioblastos transfectados na pata traseira direita e int mioblastos não transfectadoso O membro (esquerda) contralateral traseira.
- Realizar uma varredura bioluminescência base: Rapidamente transferir mouse para estágio no scanner óptico, colocando o mouse em uma posição de bruços. Ligue a linha de anestésico. Para garantir o mouse permanece anestesiado, uma segunda pessoa deve estar presente para ligar a linha de anestésico, enquanto os outros lugares o animal no scanner.
- Suavemente estender o membro traseiro para que a área de injecção é visível. Membros de fitas traseiras no lugar com um adesivo suave como fita médica.
- Fechar a câmara e garantir que a luz não pode aceder ao interior do scanner, como isto irá aumentar o sinal de fundo detectado. O scanner deve ser definido como parâmetros incluídos nas instruções do fabricante para obter imagem de bioluminescência. Especificamente, garantir "não laser" é selecionado.
- Desenhe uma região de interesse (ROI) em torno da área depenados e varredura início.
6. Injecção de Substrato Fluc, D-luciferina, em rato Mdx
<ol>7. BLI para Target Luc expressam PPM Após Implante em ratos de DMD
- Após o período de absorção, anestesiar rato de novo, como se descreveu em 5.1.
- Transferir o mouse de volta para o leitor óptico e executar outra verificação bioluminescência da mesma maneira como a verificação do fundo.
- Embora um período de 20 min a absorção deve fornecer a intensidade máxima do sinal, uma verificação subsequente pode ser realizada.
- Após a conclusão da aquisição da imagem, sacrificar o mouse de acordo com as diretrizes definidas pelo Comitê de Ética Institucional animal e do Canadian Council on Animal Care (CCAC). Isolar muscular dos membros posteriores e local imediatamente in formalina a 10% para corrigir para emblocamento parafina. Realização da coloração imuno-histoquímica para luciferase para confirmar a injeção intramuscular de mioblastos.
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Representative Results
Aquando de 50-60% de confluência, mioblastos C2C12 foram transitoriamente transfectadas com o referido gene repórter construção de fusão composta de luciferase de pirilampo [flutuações], monomérica da proteína fluorescente vermelha [MRFP] e SR39 timidina quinase [sr39tk] (Figura 1A). A eficiência de transfecção foi calculado por meio de microscopia de fluorescência (Figura 1B, C), fazendo uso da sequência MRFP na nossa construção repórter. A capacidade de sobrevivência das células não foi afectada pela marcação com o substrato BLI, D-luciferina (Figura 1D). Após transfecção, aproximadamente 100.000 MRFP expressam mioblastos foram implantadas por via intramuscular no músculo do gastrocnémio de ratinhos mdx (determinado previamente, manuscrito submetido); 100.000 células não transfectadas foram igualmente implantado no membro contralateral hind como um controlo. Implantação de células imediatamente a seguir, os ratos foram injectados intraperitonealmente (IP) com 150 mg / kg de D-luciferin. Após um período de captação de ~ 20 min, os camundongos foram fotografadas em um scanner óptico de pequenos animais (GE ExplorOptix caixa preta que está equipado para a bioluminescência de animais vivos e de fluorescência). Como anteriormente demonstrado, in vitro e pós-implantação (manuscrito submetido) absorção de D-luciferina era específico para flutuações expressam mioblastos, sem bioluminescência detectável em células não transfectadas (Fig. 2). A imuno-histoquímica confirmou que o transplante de mioblastos intramuscular (Figura 3)
Figura 1 Diagrama esquemático de construção repórter CMV-trifusion (A),. Claro / imagens de fluorescência de mioblastos C2C12 transfectadas com o plasmídeo repórter trifusion (B, C); ensaios de MTT para avaliar a capacidade de sobrevivência de células C2C12 após marcação com BLI substrato, D-lucifer em (D).
Figura 2. Imagem de bioluminescência (BLI). Uma região de interesse (ROI) é desenhado para delimitar a área de membros arrancados traseira onde mioblastos são injetados (A). A bioluminescência não é detectado durante um exame de fundo (B). Aos 23 minutos após a injeção de D-luciferina, um claro sinal é detectado a partir do membro posterior direito, onde luciferase expressam mioblastos são injetados. Não bioluminescência é detectado no membro contralateral traseira injetado com mioblastos não transfectadas (C). Clique aqui para ver maior figura .
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Figura 3. IHC utilizando um anticorpo de luciferase de pirilampo confirma implantação intramuscular de células C2C12 transfectadas.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos uma rápida e fiável molecular imaging, a abordagem de gene repórter de mioblastos não invasiva alvo / PPM após o transplante. Embora este estudo demonstra a localização de curto prazo de PPM transplantados via bioluminescense imaging (BLI), o modo pelo qual as células são alvejados podem, de facto, ser facilmente aplicado a uma avaliação longitudinal do enxerto de células, através da implantação de células que expressam estavelmente o gene repórter. Para este fim, o nosso grupo gerou linhas de ratinhos transgénicos que albergam o gene repórter unificado. Apenas as células que expressam o gene repórter de oxidar D-luciferina para produzir fótons por visualização usando BLI. Uma vez que a oxidação de D-luciferina é dependente da expressão do gene, isto é, uma poderosa tecnologia com a qual a imagem de forma não invasiva viáveis células transplantadas. O tecido muscular colhidas a partir desses camundongos transgênicos e células satélites (SCs) isoladas via FACS pode realmente ser targeted após a implantação em ratinhos mdx. Além disso, pode-se controlar o seu estado de diferenciação por meio da utilização de um promotor específico do músculo, mais aumentando a utilidade ea importância das tecnologias de imagiologia molecular, tal como apresentado no presente documento, para o campo da pesquisa de DMD (manuscrito submetido). Para além da sua rapidez e baixo custo, BLI é não-tóxico, tornando-o uma escolha atractiva para imagiologia frequente de pequenos animais. Esta característica, assim como a sua elevada especificidade, será de grande valor, em terapias de substituição de refinação mioblastos em modelos pré-clínicos de doença de distrofia muscular de Duchenne antes de avançar para estudos clinicamente aplicáveis envolvendo tecnologias, tais como PET.
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Disclosures
Autores têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Sanjiv Gambhir pelo dom do gene repórter fluc/mrfp/sr39tk. Este trabalho foi financiado pela Rede de Células-Tronco (SCN) do Canadá, e Fundação de Jesse Journey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
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