Summary
En icke-invasiv sätt att utvärdera framgång myoblast transplantation beskrivs. Metoden utnyttjar en enhetlig fusion reportergen som består av gener vars uttryck kan avbildas med olika avbildningsmetoder. Här använder vi oss av en
Abstract
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en allvarlig genetisk neuromuskulär sjukdom som drabbar 1 av 3.500 pojkar, och kännetecknas av progressiv muskeldegeneration 1, 2. Hos patienter blir förmågan hos inhemska muskelceller satellit (SCS) för att regenerera skadade myofibers allt ineffektiv 4. Därför är transplantation av muskelceller stamceller (Medelhavsländerna) / myoblaster från friska försökspersoner en lovande terapeutiskt förhållningssätt till DMD. En stor begränsning för användningen av stamcellsterapi är dock en brist på tillförlitliga imaging teknik för långsiktig övervakning av implanterade celler, och för att utvärdera dess effektivitet. Här beskriver vi en icke-invasiv, realtid strategi för att utvärdera framgång myoblast transplantation. Denna metod utnyttjar en enhetlig fusion reportergen bestående av gener (eldflugeluciferas [Fluc], monomert röd fluorescerande protein [mrfp] och sr39 tymidinkinas [sr39tk]) vars expression kan avbildas med olika avbildningsmetoder 9, 10. En mängd avbildningsmetoder, inklusive positronemissionstomografi (PET), single-photon emission datortomografi (SPECT), magnetisk resonanstomografi (MRT), optisk avbildning, och högfrekvent 3D-ultraljud finns nu, var och en med unika fördelar och begränsningar 11. Bioluminescens imaging (BLI) studier, till exempel, har fördelen av att vara relativt låg kostnad och hög genomströmning. Det är av denna anledning som, i denna studie, vi utnyttjar eldflugeluciferas (Fluc) reportergen sekvens som finns i fusionsgenen och bioluminescens imaging (BLI) på kort sikt lokalisering av livskraftiga C2C12 myoblaster efter implantation i en mus modell av DMD (muskeldystrofi på X-kromosomen [MDX] mus) 12-14. Viktigt ger BLI oss ett sätt att undersöka kinetiken för märkta Medelhavsländerna efter implantation, och kommer att vara användbart för att spåra celler upprepade gånger under tIME och följande migration. Vår reportergen ännu längre tillåter oss att slå ihop flera avbildningsmetoder i en enda levande varelse, med tanke på tomografiska natur, fina spatial upplösning och förmåga att skala upp till större djur och människor 10,11, kommer PET att ligga till grund för framtida arbete som vi föreslå kan underlätta en snabb översättning av metoder som utvecklats i celler till prekliniska modeller och kliniska tillämpningar.
Protocol
1. Underhåll och spridning av C2C12 myoblaster
- Plattan C2C12 myoblaster i en 75 cm kolv 2 och upprätthålla celler i hög glukoshalt Dulbeccos modifierade Eagles Serum (HG-DMEM) kompletterat med fetalt bovint serum (FBS) till en slutlig koncentration av 10%. Låt inte celler att bli konfluenta helst eftersom detta bryter myoblastic befolkningen. Medium bör bytas varannan dag Anmärkning:. Alltid varmt medium till 37 ° C i ett vattenbad före användning.
- När myoblaster blir ca 80% sammanflytande, passage celler till en ny kolv. Aspirera odlingsmedium. Tvätta celler med 4-5 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) för att avlägsna alla spår av odlingsmedium, vilket innehåller trypsin-hämmande serum. Kortfattat Skölj cellskiktet med 2-3 ml 0,25% (vikt / vol) trypsin-EDTA-lösning för att dissociera de vidhäftande myoblaster från kolven. Aspirera trypsin och plats kolven i inkubator vid 37 ° C under 5 minuter.
- Under denna inkubatorning, förbereda en ny kolv med 9 ml HG-DMEM/10% FBS-medium. Efter trypsinisering, tillsätt 10 ml av komplett medium till celler och pipett 4-5 gånger för att säkerställa insamling av alla celler i mediet. Tillsätt 1 ml av cellsuspension till den nya kolven och inkubera i 5% CO 2 vid 37 ° C.
2. C2C12 celltransfektion
- När cellerna har nått 50% konfluens, transfektera enligt tillverkarens instruktioner från Invitrogen. Kortfattat, kombinera 90 ul Lipofectamine 2000 reagens med 4,5 ml OPTI-MEM-medium. I ett annat rör, kombinera 36 | ig CMV-DNA-trifusion reportergen med 4,5 ml OPTI-MEM. Snärta varje rör att kombinera och vänta 5 minuter. Kombinera innehållet i båda rören, blanda försiktigt och inkubera vid rumstemperatur i exakt 30 minuter Anm:. En andra kolv bör också inrättas för otransfekterade celler som endast får Lipofectamine och OPTI-MEM för att tjäna som en negativ kontroll.
- Avlägsna medium från C2C12-celler och tillsätt 15,5ml färsk HG-DMEM/10% FBS-medium. Lägg transfektion medel för att få den totala volymen till 20 ml.
- Tillåt celler att transfektera natten under minst 20 h vid 37 ° C.
- Nästa dag, aspirera transfektion medium och tillsätt 10 ml HG-DMEM/10% FBS.
- Visa celler under ett inverterat fluorescensmikroskop. Fånga både ljusa fält och röd fluorescens bilder (med hjälp av en TRITC filter kub, mrfp ex / em: 584/607 nm). Räkna antalet RFP-uttryckande celler visade i fluorescens dividerat med totala antalet celler visade under starkt fält för flera synfält för att generera transfektionseffektivitet.
3. Bedömning av Cell Överlevnadsförmåga / MTT-analys
- En dag före transfektion, plattan 1x10 5 C2C12-celler till varje brunn i en 24-brunnsplatta. Cellerna bör pläteras i 500 pl volymer i HG-DMEM/10% FBS.
- Nästa dag, transfektera myoblaster natten såsom tidigare beskrivits. Följ tillverkarens förslag för transfektion reagent volymer för en 24-brunnars platta. Inkubera en uppsättning brunnar med Lipofectamine endast (inget DNA) som en kontroll. Visa celler under fluorescens för att säkerställa att rätt transfektion har inträffat.
- Avlägsna transfektion medium och inkubera myoblaster med 5 mg / ml tiazolyl tetrazolium bromid (MTT) i HG-DMEM/10% FBS. Lägg D-luciferin till åtta av de transfekterade brunnarna och inkubera vid 37 ° C under fyra timmar.
- Avlägsna medium från brunnarna. Solubilisera blå formazankristaller genom tillsats 180 pl isopropanol till varje brunn. Skaka vid 37 ° C under 15 minuter.
- Undvika fällning, pipett lösning i en 96-brunnars platta och läs absorbansen vid 575 nm.
4. Beredning av myoblaster för transplantation
- Ta medium tvätta myoblaster med HBSS och Trypsinisera celler som beskrivs i 1,1.
- Återsuspendera celler i 4 ml komplett medium.
- Med hjälp av en hemocytometer, räkna celler för att generera volymer innehållande 10 6 myoblaster. Pipettera Volume i sterila 1,5 ml mikrorör. Med en transfektion effektivitet ~ 10%, dessa värden indikerar att 100.000 luciferas-uttryckande celler detekteras på GE ExploreOptix scannern efter transplantation.
- Uppnå en slutlig injektionsvolym av 15 ul, innehållande 10 6 C2C12-celler. Om nödvändigt, centrifugera mikrorör vid 2.000 rpm under en minut. Försiktigt aspirera supernatanten med en pipett. Återsuspendera celler i 15 ul HG-DMEM som saknar FBS.
5. Cellimplantation
- Söva mus med 2% isofluran / 2% O 2. Plocka hår från rygg bakbenen område. Upprätthålla anestesi vid 1,5% isofluran / 2% O 2.
- Se till C2C12 myoblaster är väl avbrutits. Med musen i liggande ställning, förlänga bakbenen och använder en insulinspruta att injicera celler direkt i den laterala huvudet av gastrocnemius vid en 30 ° vinkel. Injicera transfekterade myoblaster i den högra bakbenen och otransfekterade myoblaster into den kontralaterala (vänstra) bakben.
- Utför en genomsökning baslinje bioluminiscens: Snabbt överföra musen för steg i den optiska skannern, om musen i en liggande ställning. Koppla upp anestetiska linjen. För att säkerställa att musen är bedövad, bör en andra person vara närvarande för att koppla in den anestetiska linjen medan de andra platserna djuret i skannern.
- Försiktigt sträcka bakbenet så området av insprutningen är synlig. Tape bakbenen på plats med en mild klister som medicinsk tejp.
- Stäng kammaren och att inget ljus kan komma åt insidan av skannern, eftersom detta kommer att öka bakgrunden detekteras. Skannern ska vara inställd på parametrar som ingår i ditt tillverkarens instruktioner för bioluminescens imaging. Specifikt se "ingen laser" har valts.
- Rita en region av intresse (ROI) runt plockade området och börja skanna.
6. Injektion av Fluc substrat, D-luciferin, till Mdx mus
<ol>7. BLI till Target Luc-uttryckande Medelhavsländerna Efter implantatet i musmodeller av DMD
- Efter upptag perioden söva musen igen, enligt beskrivningen i 5,1.
- Överför musen tillbaka till den optiska skannern och utföra en annan bioluminiscens skanna på samma sätt som bakgrunden skanningen.
- Även om en 20 min upptag period bör ge maximal signalintensitet kan en efterföljande genomsökning utföras.
- Efter avslutad bildtagning, offra musen enligt riktlinjer som fastställs av din Institutional Animal etikkommittén och den kanadensiska rådet om Animal Care (CCAC). Isolera bakbenen muskler och omedelbart jagn 10% formalin för att fixa till paraffin ingjutning. Utför immunohistokemi färgning för luciferas att bekräfta intramuskulär injektion av myoblaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid 50-60% konfluens, var C2C12 myoblaster transient transfekterade med ovan nämnda fusion reportergenkonstruktionen sammansatt av eldflugeluciferas [Fluc], monomert röd fluorescerande protein [mrfp] och sr39 tymidinkinas [sr39tk] (Figur 1A). Transfektionseffektivitet beräknades genom fluorescensmikroskopi (figur 1B, C), som använder sig av mrfp sekvensen i vår reporterkonstrukt. Cell överlevnadsförmåga påverkades inte av märkning med BLI substratet, D-luciferin (figur 1D). Efter transfektion cirka 100.000 mrfp-uttryckande myoblaster implanteras intramuskulärt i gastrocnemiusmuskeln i mdx-möss (bestämd tidigare manuskript inlämnat), 100.000 otransfekterade celler liknande implanterades i den kontralaterala bakbenet som en kontroll. Omedelbart efter cellimplantation, injicerades möss intraperitonealt (IP) med 150 mg / kg D-luciferin. Efter en upptagning tid ~ 20 minuter, möss avbildas på ett litet djur optisk skanner (GE ExplorOptix svart låda som är utrustad för levande djur bioluminiscens och fluorescens). Såsom tidigare visats, både in vitro och efter implantation (manuskript) upptag av D-luciferin var specifik för sväng-uttryckande myoblaster, utan någon detekterbar bioluminiscens i otransfekterade celler (Figur 2). Immunohistokemi bekräftade intramuskulär transplantation av myoblaster (Figur 3)
Figur 1 Schematisk av CMV-trifusion reporterkonstruktion (A),. Ljusfält / fluorescensbilder av C2C12 myoblaster transfekterade med trifusion reporterplasmiden (B, C), MTT-analys för att bedöma C2C12 cells överlevnadsförmåga efter märkning med BLI substrat, D-Lucifer i (D).
Figur 2. Bioluminescens imaging (BLI). En region av intresse (ROI) dras att innesluta plockade bakbenen där myoblaster injiceras (A). Bioluminiscens inte upptäcks vid en bakgrund skanning (B). Vid 23 minuter efter injektion av D-luciferin, är en tydlig signal detekteras från den högra bakbenet där luciferas-uttryckande myoblaster injiceras. Ingen bioluminiscens detekteras i kontralaterala bakbenet injiceras med otransfekterade myoblaster (C). Klicka här för att se större bild .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
Figur 3. IHC med användning av en eldflugeluciferas antikropp bekräftar intramuskulär implantation av transfekterade C2C12-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi beskrivit en snabb och pålitlig molekylär avbildning, tillvägagångssätt reportergen för icke-invasiva mål myoblaster / Medelhavsländerna efter transplantation. Även denna studie visar på kort sikt lokalisering av transplanterade Medelhavsländerna via bioluminescense avbildning (BLI), det sätt på vilket celler riktade kan i själva verket lätt att en längsgående bedömning av cell ympning tillämpas genom implantation av celler som stabilt uttrycker reportergenen. I detta syfte har vår grupp genererat transgena mus linjer som hyser den enhetliga reportergenen. Endast celler som uttrycker reportergenen oxidera D-luciferin att producera fotoner för visualisering med BLI. Eftersom oxidationen av D-luciferin är beroende genuttryck, är detta en kraftfull teknik med vilken icke-invasiva image viabla transplanterade celler. Muskelvävnad skördas från dessa transgena möss och satellit celler (SCS) isolerade genom FACS kan faktiskt vara targeted. efter implantation in mdx-möss. Dessutom kan vi följa deras differentiering status genom användning av en muskel-specifik promotor, ytterligare skärper användbarhet och betydelse av molekylära bildtekniker, såsom presenteras häri, till området för DMD forskning (manuskript). Utöver sin snabbhet och låg kostnad, är BLI icke-toxisk, vilket gör det till ett attraktivt val för frekvent avbildning av små djur. Denna funktion, liksom dess höga specificitet kommer att vara ovärderlig för raffinering behandlingar myoblast ersättning i prekliniska sjukdomsmodeller för Duchennes muskeldystrofi innan avancera till kliniskt tillämpliga studier tekniker som PET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Sanjiv Gambhir för gåva fluc/mrfp/sr39tk reportergenen. Detta arbete har finansierats av stamceller Network (SCN) i Kanada och Jesse färd Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
