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Biology

प्लाज्मा Retinol बाइंडिंग प्रोटीन की झिल्ली रिसेप्टर द्वारा वास्तविक समय Retinol परिवहन का विश्लेषण

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

यहाँ हम एक अनुकूलित करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले विटामिन ए / RBP जटिल और दो वास्तविक समय की निगरानी करने के लिए विटामिन STRA6, RBP रिसेप्टर परिवहन अध्ययन तकनीक उत्पादन तकनीक का वर्णन करता है.

Abstract

विटामिन ए दृष्टि के लिए आवश्यक है और लगभग सभी मानव अंगों के विकास / भेदभाव. प्लाज्मा retinol बाध्यकारी प्रोटीन (RBP) और रक्त में विटामिन की विशिष्ट वाहक सिद्धांत है. यहाँ हम एक अनुकूलित उत्पादन और holo RBP और दो वास्तविक समय की निगरानी तकनीकों शुद्ध करने के लिए उच्च आत्मीयता RBP STRA6 रिसेप्टर द्वारा विटामिन ए की परिवहन अध्ययन तकनीक का वर्णन करता है. पहली तकनीक के उच्च गुणवत्ता के लिए विटामिन (retinol के साथ 100% लोड) holo-RBP परिवहन assays की एक बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए यह संभव बनाता है. उच्च गुणवत्ता RBP कार्यात्मक assays के लिए आवश्यक है क्योंकि RBP विज्ञप्ति विटामिन misfolded RBP तैयारी में आसानी से और बैक्टीरियल संदूषण कलाकृतियों को पैदा कर सकता है. वास्तविक समय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तरह निगरानी तकनीक झिल्ली परिवहन के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया है. RBP रिसेप्टर की मध्यस्थता retinol परिवहन हाल ही में जब तक वास्तविक समय में नहीं किया गया विश्लेषण किया गया है. 2 यहाँ वर्णित तकनीक वजह विनिर्माण कर रहे हैSTRA6 उत्प्रेरित retinol रिहाई या लोड के एल समय विश्लेषण. 3 तकनीक STRA6 उत्प्रेरित retinol holo-RBP से सेलुलर retinol बाध्यकारी प्रोटीन मैं (CRBP-I) के लिए परिवहन की वास्तविक समय विश्लेषण है. इन तकनीकों में उच्च और खुलासा RBP रिसेप्टर विटामिन ए तेज तंत्र में संवेदनशीलता संकल्प प्रदान करते हैं.

Introduction

विटामिन ए एक कार्बनिक अणु है कि मानव अस्तित्व और लगभग सभी मानव अंगों के समुचित कार्य के लिए आवश्यक है. विटामिन ए डेरिवेटिव (retinoids) दृष्टि 1,2 और भ्रूण विकास के दौरान और वयस्क 3-6 ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति और प्रोटीन अनुवाद के विनियमन के लिए प्रकाश की संवेदन सहित विविध जैव रासायनिक और सेलुलर घटनाओं में भाग लेते हैं. हालांकि retinol प्रणालीबद्ध फैलाना की क्षमता है, विकास प्लाज्मा retinol बाध्यकारी प्रोटीन, उच्च दक्षता और विशिष्टता प्राप्त करने और यादृच्छिक 7-10 प्रसार के साथ जुड़े विषाक्तता से बचने के लिए रक्त में एक परिवहन विटामिन के लिए एक विशिष्ट वाहक प्रोटीन के साथ आया था. एक उच्च आत्मीयता रिसेप्टर है कि RBP बांधता है और विटामिन लेता 11-13 1970 के दशक में धारणा थी. RBP 14-31 रिसेप्टर के अस्तित्व पर तीन दशकों में संचित सबूत होने के बावजूद, रिसेप्टर परिकल्पना के कारण कई वर्षों के लिए existenc बहस हुई थीholo RBP की एक गलत परिभाषा के ई. holo RBP की सही परिभाषा यह है कि यह retinol और RBP के बीच उच्च आत्मीयता 01:01 जटिल है. कार्बनिक विलायक holo RBP की दोहराया निष्कर्षण APO RBP उत्पादन के लिए आवश्यक है. इस परिभाषा के लगभग सभी RBP 7,9,32-35 या RBP 14-31,36-42 रिसेप्टर का अध्ययन प्रयोगशालाओं द्वारा किया जाता है. holo RBP की गलत परिभाषा है कि RBP रिसेप्टर के अस्तित्व खंडन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था APO - RBP साथ मुक्त retinol के तीव्र मिश्रण है. विटामिन में RBP रिसेप्टर के समारोह के बाद से holo RBP से एक तेज holo RBP से retinol जारी है, RBP रिसेप्टर retinol तेज में कोई भूमिका नहीं निभा अगर retinol मुक्त है के साथ शुरू करने (holo की गलत परिभाषा के द्वारा प्रस्तावित )-RBP.

RBP रिसेप्टर एक multitransmembrane डोमेन प्रोटीन के रूप में पहचान की हाल ही STRA636 बुलाया और विटामिन में अपनी समारोह holo-RBP 36-43 से एक तेज दृढ़ता परिकल्पना है कि नहीं करता है RBP के खिलाफ तर्कएक रिसेप्टर के लिए विटामिन ए विस्तृत विश्लेषण करती है पता चला कि STRA6 9 transmembrane डोमेन एन टर्मिनस के साथ extracellularly स्थित और सी टर्मिनस 40 intracellularly स्थित है देने की जरूरत है. Transmembrane 6 और 7 के बीच स्थित एक आवश्यक RBP बाध्यकारी 39 डोमेन है. STRA6 दोनों LRAT और CRBP मैं holo RBP से एक तेज विटामिन में युग्मित है, लेकिन न तो LRAT न ही CRBP मैं बिल्कुल बढ़ाया 41 STRA6 गतिविधि के लिए आवश्यक है. है STRA6 holo RBP से retinol रिहाई को उत्प्रेरित करने की क्षमता अपने विटामिन ए तेज 41 गतिविधि करने के लिए महत्वपूर्ण है. STRA6 पर भरोसा करने के लिए अपने retinol जारी करके, विटामिन RBP द्वारा एक वितरण करने के लिए एक उच्च विशिष्टता और दक्षता के साथ परिधि के ऊतकों में कोशिकाओं को लक्षित विटामिन परिवहन कर सकते हैं.

holo RBP परिभाषा और तैयारी के महत्व को न केवल RBP रिसेप्टर के अस्तित्व पर ऐतिहासिक बहस के द्वारा सचित्र है, लेकिन यह भी तीन संबंधित हाल ही में holo RBP परिभाषाओं अलग आधार पर कागजातमूल और सही परिभाषा 44-46 से अलग है. पहले कागज holo-RBP परिभाषा कि RBP RBP रिसेप्टर 44 अध्ययन रिसेप्टर के अस्तित्व को अस्वीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. दूसरे और तीसरे कागजात holo-RBP की एक तिहाई परिभाषा है कि यह retinol के लिए कम होने की संभावना भी अध्ययन किया जा 45,46 RBP साथ उचित जटिल फार्म के साथ आया था. इन अध्ययनों 3 एच retinol holo RBP (भी नहीं APO RBP) के मिश्रण से 3 H-retinol/RBP तैयार. चूंकि इस परख नहीं था 3 H-retinol/RBP का गठन किया था और अत्यधिक मुक्त 3 45,46 एच retinol को दूर नहीं है, यह एक परख से 3 H-retinol/RBP 3 एच retinol तेज के लिए, नहीं है लेकिन एक स्वतंत्र है 3 एच retinol प्रसार परख. यह पहले से दिखाया गया है कि STRA6 LRAT 38 या 41 CRBP मैं मुक्त retinol के सेलुलर तेज वृद्धि नहीं करता है. वस्तुतः सभी retinol के रक्त में RBP ही है और वहाँ कोई detectable fre हैई retinol. RBP रिसेप्टर के एक मुख्य समारोह holo RBP से holo - RBP 41 से retinol तेज दौरान retinol रिहाई को उत्प्रेरित करने के लिए है. यदि retinol या कृत्रिम रूप से जारी की है और मुक्त रूप में 45,46 के साथ शुरू करते हैं, RBP रिसेप्टर की जरूरत नहीं है. नाटकीय रूप से अलग से प्राप्त मुक्त retinol प्रसार परख के रूप में सही ढंग से तैयार holo-RBP RBP की है कि सही तैयारी वर्णन पर आधारित assays के लिए तुलना परिणाम इसके कार्यात्मक assays के लिए महत्वपूर्ण है.

RBP मानव सीरम 41 से शुद्ध किया जा सकता है, लेकिन प्रक्रिया जटिल है और उपज कम है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण ई. में RBP उत्पादन कोलाई क्योंकि ई. कोलाई RBP तरह डाइसल्फ़ाइड बांड की एक से अधिक जोड़ी के साथ सही ढंग से स्तनधारी secreted प्रोटीन गुना करने की क्षमता नहीं है, यह refold RBP और सही ढंग से मुड़ा हुआ प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आवश्यक है. Misfolded प्रोटीन सही विभिन्न assays में जोड़ RBP से अलग ही व्यवहार नहीं है,लेकिन यह भी भंडारण के दौरान प्रोटीन एकत्रीकरण कारण. उसी कारण से, APO RBP केवल उच्च गुणवत्ता holo RBP से निर्मित है. हम यहाँ एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए उच्च गुणवत्ता RBP 100% बैक्टीरियल अभिव्यक्ति, refolding और HPLC शोधन के माध्यम से retinol के साथ भरी हुई हैं. HPLC शोधन न केवल गलत तरीके से मुड़ा हुआ है, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण जीवाणु संक्रमण है कि गंभीर कलाकृतियों कारण अगर RBP संकेत पारगमन assays में प्रयोग किया जाता है RBP हटा. हम भी दो संवेदनशील वास्तविक समय की निगरानी लिए STRA6 द्वारा retinol परिवहन अध्ययन तकनीक का वर्णन. दोनों तकनीकों उच्च गुणवत्ता RBP पर निर्भर करते हैं. अंतरिक्ष सीमाओं के कारण, रेडियोधर्मी retinoid आधारित और HPLC आधारित विटामिन की क्लासिक तकनीक एक तेज assays यहाँ नहीं वर्णित हैं.

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Protocol

1. उत्पादन, refolding, और Holo - RBP की HPLC शोधन

  1. BL-21cells pET3a वेक्टर एन टर्मिनस पर 6x उनके टैग के साथ मानव RBP लिए सीडीएनए को शरण देने के साथ रूपांतरण. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में तब्दील BL 21-कोशिकाओं कार्बेनिसिलिन साथ 40 मिलीलीटर लेग मीडिया में 600 एनएम पर आगे बढ़ें आयुध डिपो जब तक 0.5 तक पहुँचता है. 1mm के लिए IPTG जोड़कर RBP प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित. 37 में बैक्टीरिया बढ़ने ° C एक और 5 घंटा.
  2. ई. कोलाई में उत्पादित RBP ज्यादातर अघुलनशील समावेश शरीर में मौजूद है. 20 मिनट के लिए 10,000 XG पर शामिल किए जाने के निकायों, गोली कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए. फिर 5 एमएल पीबीएस में protease inhibitors, ठंड और विगलन के 2 चक्र द्वारा पीछा के साथ बर्फ पर कोशिकाओं sonicate. नीचे गोली 4 बजे 30 मिनट के लिए 20,000 XG पर समावेश शरीर डिग्री सेल्सियस तैरनेवाला निकालें और बर्फ पर गोली रखने के.
  3. 10 मिलीलीटर 7.5 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड में sonication से शामिल किए जाने के शरीर गोली solubilize. एक अंतिम ग 25 मिमी Tris बफर, पीएच 9.0 और डीटीटी के एक आधे की मात्रा जोड़ें (5 मिलीलीटर)10 मिमी की oncentration. सख्ती कमरे के तापमान पर रात भर के लिए पूरी तरह से कम करने के लिए और प्रोटीन denature एक भंवर मिक्सर पर समाधान मिश्रण.
  4. 18,000 XG पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अघुलनशील सामग्री हटाने के लिए प्रोटीन समाधान अपकेंद्रित्र स्पिन के बाद, एक नया ट्यूब तैरनेवाला हस्तांतरण ट्यूब और बर्फ पर जगह है.
  5. Refolding बफर के चार (60 मिलीग्राम) मात्रा (25 मिमी Tris, पीएच 9.0, 0.3 मिमी cystine, 3.0 मिमी सिस्टीन, 1 मिमी EDTA) तैयार करें. Degas refolding बफर. इथेनॉल में मंद लाल बत्ती के तहत 600 μl 10 मिमी retinol तैयार. अंधेरे में यह बर्फ पर रखें. दोनों refolding बफर और retinol समाधान हौसले से तैयार होने की जरूरत है.
  6. दोनों प्रोटीन समाधान और कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर refolding बफर बढ़िया. उच्च तापमान की संभावना RBP refolded की गुणवत्ता को कम कर देता है. 1 मिलीग्राम refolding बफर dropwise और बदले में 10 μl retinol समाधान जबकि प्रोटीन समाधान सख्ती बर्फ पर एक बीकर में मिलाया जाता है. सभी refolding बफर और retinol जब तक इस चरण को दोहराएँकर रहे हैं जोड़ा. 5 घंटे के लिए अंधेरे में बर्फ पर प्रतिक्रिया सरगर्मी रखें.
  7. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए +२४००० XG refolding प्रतिक्रिया स्पिन यह refolding प्रतिक्रिया के बाद सही समुच्चय को दूर करने के लिए आवश्यक है.
  8. तैरनेवाला समाधान के बारे में 10 मिलीलीटर Amicon अल्ट्रा 15 concentrator (MWCO 10 कश्मीर) का उपयोग ध्यान लगाओ. Refolded समाधान इस स्तर की तुलना में अधिक ध्यान केंद्रित नहीं है. बहुत ज्यादा ध्यान केंद्रित प्रोटीन एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व और अंतिम और सही ढंग मुड़ा RBP की उपज की गुणवत्ता को कम करती है. ठंड पीबीएस के साथ 100 मिलीलीटर नमूना केंद्रित पतला. इस कदम का उद्देश्य refolding प्रतिक्रिया कि निकल शुद्धि के साथ हस्तक्षेप में घटकों को दूर करने के लिए है.
  9. समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 24,000 XG पर एक अधिक समय स्पिन यह महत्वपूर्ण है के लिए किसी भी तलछट हटाने. दो 50 मिलीलीटर ट्यूब, जिनमें से प्रत्येक में 1 मिलीलीटर नी NTA घोल कि पीबीएस के साथ धोया गया है तैरनेवाला स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक घंटे के लिए ट्यूब घुमाएँ. पतला समाधान च Incubatingया 1 घंटा misfolded प्रोटीन जो हटा दिया जाना चाहिए की संभावना पैदा कर सकता है.
  10. नीचे 3 मिनट के लिए 500 XG ट्यूबों स्पिन. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें. कुछ भी फ्लोटिंग हटाया जाना चाहिए. प्रत्येक ट्यूब के लिए 30 मिलीलीटर ठंड पीबीएस जोड़ें. फिर से स्पिन और तैरनेवाला हटा दें. इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक आप ट्यूब में मोती, लेकिन कुछ भी नहीं देखते हैं.
  11. एक खाली कॉलम राल नी NTA स्थानांतरण. 20 से 10 मिमी imidazole, पीबीएस में 500 मिमी NaCl के स्तंभ की मात्रा के साथ राल धो लें. 5 पीबीएस में 100 मिमी imidazole स्तंभ खंडों में उनकी RBP Elute. समय की एक विस्तारित अवधि के लिए स्टोर नहीं इस समाधान और ठंड अंतिम उपज और गुणवत्ता को कम कर देता है. सर्वोत्तम परिणाम के लिए, HPLC द्वारा RBP तुरंत शुद्ध.
  12. नी NTA 25 मिमी Tris, पीएच 8.4, और 120 मिमी NaCl के खिलाफ राल से शुद्ध अपने RBP Dialyze. Concentrator भी बफर के आदान प्रदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्पष्ट 4 ° C सही प्रत्येक रन से पहले 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर centrifugation द्वारा HPLC के लिए नमूने हैं.
  13. Holo-RBP HPLC पर शुद्ध एक आयन का उपयोगविनिमय (220 मिमी 12 मिनट, 360 मिमी 15 मिनट, और 1000 मिमी 15 मिनट) एक NaCl कदम ढाल 1 मिलीग्राम / मिनट पर मोबाइल चरण के रूप में 25 मिमी Tris, पीएच 8.4 का उपयोग करके स्तंभ AX-300. NaCl एकाग्रता के रूप में उगता है, holo उसकी RBP APO - RBP जबकि जारी है और misfolded RBP स्तंभ (1 चित्रा) के लिए बाध्य रहते हैं. यदि RBP refolding बेहतर नहीं किया जाता है, (जैसे कि चित्र 1 में RBP मैं misfolded) RBP पूरी तैयारी प्रबल कर सकते हैं misfolded.
  14. 360 मिमी NaCl में शिखर भागों से सही ढंग से मुड़ा holo RBP पुनर्प्राप्त. ध्यान से सही ढंग से मुड़ा और उसकी RBP misfolded क्षालन प्रोफाइल की निगरानी. 1000 मिमी NaCl, सबसे misfolded उसकी RBP रिहा किया जाना चाहिए.
  15. Holo RBP युक्त Fractions जमा केंद्रित है, और PBS के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात dialyzed अंतिम और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा गुणवत्ता (330 nm/280 एनएम) उपज की जाँच करें. सही ढंग से मुड़ा उत्पाद एक 330 nm/280 थोड़ा 1 (चित्रा 1) से अधिक की एनएम अनुपात होना चाहिए.
  16. उत्पादन के लिएAPO - RBP ई, holo RBP शुद्ध हेपटैन की एक समान मात्रा जोड़ने के लिए और रातोंरात घूर्णन द्वारा धीरे से 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 छ अपकेंद्रित्र और ध्यान से एक नया ट्यूब (अंतरफलक पर वेग से बचने) नीचे जलीय चरण हस्तांतरण. प्रत्येक के लिए एक 3 घंटा ऊष्मायन प्रक्रिया के साथ तीन बार दोहराएँ. एक Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को यकीन है कि 330 एनएम चोटी पृष्ठभूमि स्तर में कमी आई है पर अवशोषण की जाँच करें.

2. वास्तविक समय की निगरानी STRA6 उत्प्रेरित Retinol रिलीज और Retinol लोड हो रहा है

  1. अवरोधक कैसिइन (पियर्स) के 200 μl के साथ 4 में एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली Microfluor 2 (थर्मो वैज्ञानिक) रातोंरात ब्लॉक ° सी holo RBP की nonspecific प्लास्टिक चिपके को रोकने के. अवरोधक कैसिइन सभी अवरुद्ध समाधान हम परीक्षण के सर्वश्रेष्ठ अवरुद्ध प्रभाव देता है.
  2. हौसले STRA6 या नियंत्रण कक्ष व्यक्त कोशिकाओं से तैयार झिल्ली पीबीएस का उपयोग धो रहे हैं और एक हैमिल्टन सिरिंज (Gasti के माध्यम से पारित1710 # ght) 6 बार पीबीएस में एक समान निलंबन का उत्पादन. हम आम तौर पर 1 / एक प्रतिक्रिया प्रति 100 मिमी पकवान पर विकसित कोशिकाओं के 100 1/20 से व्युत्पन्न झिल्ली का उपयोग करें.
  3. प्लेट Microfluor-2 के लेपित कुओं एक बार धो पीबीएस के 200 μl के साथ. झिल्ली निलंबन (अच्छी तरह से प्रति 50 μl) के अलावा बर्फ पर थाली से पहले शांत.
  4. Retinol प्रतिदीप्ति की वास्तविक समय की निगरानी उत्तेजना फिल्टर 320ex और उत्सर्जन 460-10 फिल्टर के साथ POLARstar ओमेगा (बीएमजी Labtech) प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी का उपयोग मापा जाता है. कार्यक्रम Endpoint पठन मोड सेट कर दिया जाता है. प्लेट मोड भी एक समय कोर्स को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर समय अंतराल नहीं विविध रहे हैं. हर समय बिंदु से संकेत 10 माप (2 मिमी की एक व्यास के साथ कक्षीय औसत) के औसत है और लाभ 1800 में सेट कर दिया जाता है. थाली 10 सेकंड के लिए प्रत्येक माप से पहले डबल कक्षीय झटकों का उपयोग 500 rpm पर हिल रहा है.
  5. Retinol रिहाई परख शुरू, कुओं Endpoint मीटर पढ़ने का उपयोग कर एक बार पढ़ रहे हैंholo RBP पहले क़सीदा (आम तौर पर 1 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) 0 मिनट पर जोड़ा जाता है. के रूप में जल्द ही के रूप में holo RBP जोड़ा जाता है, प्रतिक्रिया लगातार 1-3 घंटे के लिए हर 5-10 मिनट पर नजर रखी है. Retinol लदान परख, सभी पार retinol (आमतौर पर 1 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) शुरू मंद लाल बत्ती के तहत कुओं के लिए जोड़ा गया है. प्लेट एक बार पढ़ा है पहले APO RBP 0 मिनट में जोड़ा जाता है. के रूप में जल्द ही APO RBP जोड़ा जाता है, प्रतिक्रिया लगातार 1-3 घंटे के लिए हर 5-10 मिनट पर नजर रखी है.
  6. बाद सभी मापन किया जाता है, ओमेगा डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (बीएमजी Labtech) से कच्चे (2 चित्र में दिखाए गए उदाहरण) डेटा विश्लेषण के लिए Microsoft Excel में डेटा डाउनलोड. हर बार एक फाइल है जिसमें सभी प्रयोगात्मक शर्तों की रीडिंग उत्पन्न करता है. उदाहरण के लिए, अगर वहाँ 20 समय अंक हैं, डेटा विश्लेषण के लिए एक एक्सेल फाइल में 20 फाइलें मजबूत.
  7. डेटा विश्लेषण के लिए, retinol या holo-RBP 0 मिनट में के अलावा पहले प्रतिदीप्ति संकेतों पृष्ठभूमि संकेतों एक माना जाता हैहर समय अंक पर अंतिम प्रतिदीप्ति संकेतों से घटाया. हालांकि पृष्ठभूमि संकेतों कम holo RBP में retinol प्रतिदीप्ति तुलना कर रहे हैं, subtracting पृष्ठभूमि झिल्ली से प्रकाश बिखरने का nonspecific प्रभाव समाप्त और यह holo RBP या retinol retinol प्रतिदीप्ति 0 मिनट में जोड़ा पर ध्यान केंद्रित करने के लिए संभव बनाता है.

3. Holo RBP से वास्तविक समय Retinol के परिवहन STRA6 उत्प्रेरित CRBP मैं निगरानी

  1. Retinol EGFP एक नया प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि (झल्लाहट) हस्तांतरण जोड़ी है कि हाल ही में 41 से स्थापित किया गया है. Retinol STRA6 उत्प्रेरित परिवहन झल्लाहट holo-RBP से EGFP-CRBP मैं वास्तविक समय में retinol EGFP मापने के द्वारा निगरानी रखी जाती है. EGFP-CRBP मैं 6XHis टैग (EGFP CRBP-I) के साथ संलयन प्रोटीन स्तनधारी कोशिकाओं में उत्पादन किया है और प्रयोग से पहले नी NTA राल पर शुद्ध है. EGFP-CRBP मैं समय की एक छोटी अवधि के लिए protease inhibitors के साथ पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है मैं वैकल्पिक रूप से संलयन प्रोटीन-80 ° छोटे aliquots सी में जमे हुए है.
  2. प्रतिक्रियाओं से पहले, एक अवरुद्ध Microfluor-2 थाली झिल्ली और ऊपर वर्णित के रूप में तैयार करते हैं. थाली Microfluor 2 लेपित कुओं एक बार झिल्ली निलंबन (अच्छी तरह से प्रति μl 50) के अलावा पहले 200 μl पीबीएस के साथ धो लें.
  3. वास्तविक समय retinol EGFP झल्लाहट उत्तेजना फिल्टर 320ex और उत्सर्जन 460-10 और 510-10 फिल्टर साथ POLARstar ओमेगा साथ द्वंद्वयुद्ध उत्सर्जन प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी का उपयोग का उपयोग कर मापा जाता है. कार्यक्रम Endpoint पठन मोड सेट कर दिया जाता है. प्लेट मोड भी एक समय कोर्स को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर समय अंतराल नहीं विविध रहे हैं. हर समय बिंदु से संकेत 10 माप (2 मिमी की एक व्यास के साथ कक्षीय औसत) के औसत है और लाभ 1,800 प्रति चैनल सेट कर दिया जाता है. थाली 10 सेकंड के लिए प्रत्येक माप से पहले डबल कक्षीय झटकों का उपयोग 500 rpm पर हिल रहा है.
  4. कुओं प्रतिक्रियाओं, EGFP-CRBP मैं (आमतौर पर 1 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) शुरू करने के लिए जोड़ा है. थाली पर पढ़ा हैholo RBP पहले Endpoint पढ़ने मोड का उपयोग ce 0 मिनट में जोड़ा जाता है. के रूप में जल्द ही के रूप में holo RBP जोड़ा जाता है, प्रतिक्रिया लगातार माप द्वारा 1-2 घंटा के लिए हर 5-10 मिनट पर नजर रखी है.
  5. बाद सभी मापन किया जाता है, ओमेगा डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर से कच्चे डेटा (3 चित्र में दिखाए गए उदाहरण) Microsoft Excel में डेटा विश्लेषण के लिए ऊपर वर्णित के रूप डाउनलोड करें.
  6. Retinol EGFP झल्लाहट / स्वीकर्ता दाता उत्सर्जन चोटियों 47 के अनुपात में गतिशील परिवर्तन द्वारा गणना की है. 41 समीकरण इस अनुपात की गणना है (510 -510 टी बी) / (460 -460 टी ख)], 510 टी, 510 ख, 460 टी, और 460 ख प्रतिक्रिया की दीक्षा के बाद 510 एनएम पर उत्सर्जन का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां ( टी = बिंदु समय), retinol या holo-RBP पहले 510 एनएम (ख = पृष्ठभूमि) जोड़ा जाता है, प्रतिक्रिया (टी = समय बिंदु) की दीक्षा के बाद 460 एनएम, और retinol या holo-RBP पहले 460 एनएम पर जोड़ा जाता है (ख = पृष्ठभूमि), क्रमशः.

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Representative Results

हम HPLC द्वारा holo RBP - उत्पादन और शोधन (1 चित्रा), STRA6 उत्प्रेरित holo-RBP और retinol loading APO - RBP में (2 चित्रा) और वास्तविक समय विश्लेषण के से retinol रिलीज के वास्तविक समय विश्लेषण के लिए यहाँ के प्रतिनिधि के परिणाम पेश retinol STRA6 उत्प्रेरित holo RBP से EGFP CRBP - मैं परिवहन (3 चित्रा).

Refolding बिना, RBP बैक्टीरिया में उत्पादन किया है लगभग पूरी तरह से कई गलत डाइसल्फ़ाइड बांड की उपस्थिति के कारण misfolded. इसलिए, ligand retinol की उपस्थिति में refolding अच्छी तरह से जोड़ RBP प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है. हमने पाया है कि अगर refolding प्रतिक्रिया सही ढंग से नहीं किया जाता है, RBP प्रजातियों (जैसे चित्रा 1 में RBP मैं misfolded) पूरी तैयारी और उच्च गुणवत्ता की उपज holo RBP बहुत कम HPLC शोधन के बाद हो सकता है प्रबल कर सकते हैं misfolded. इसलिए, HPLC गरीब refolding की समस्या सही नहीं हो सकता. के रूप में दिखाया (1 चित्रा) से काफी कम है. हालांकि आंशिक रूप से misfolded RBP अभी भी retinol बांधता है, जटिल / retinol RBP बहुत कम स्थिर है, और अधिक आसानी से RBP retinol बाध्य विज्ञप्ति. Misfolded RBP RBP या विटामिन ए से संबंधित प्रयोगों से गलत निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. सही ढंग से मुड़ा RBP के बीच और RBP misfolded एक और अंतर यह है कि सही ढंग से मुड़ा holo RBP 4 साल के लिए स्थिर है ° सी पीबीएस में. अगरholo-RBP तैयारी RBP संदूषण misfolded है, अघुलनशील सामग्री भंडारण की एक अवधि के बाद उभरकर सामने आएगी. अघुलनशील सामग्री 4 डिग्री सेल्सियस नीचे उच्च गति पर कताई समाधान के बाद देखा जा सकता है Apo RBP केवल उच्च गुणवत्ता holo RBP से उत्पादन किया है.

एक बार उच्च गुणवत्ता holo RBP या APO - RBP शुद्ध के लिए उपलब्ध है, यह STRA6 उत्प्रेरित retinol परिवहन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दोनों वास्तविक समय retinol रिहाई परख और retinol loading परख retinol प्रतिदीप्ति निगरानी पर निर्भर करते हैं. Retinol प्रतिदीप्ति की कृत्रिम कमी का एक स्रोत RBP nonspecific प्लास्टिक पकवान (एक बार RBP प्लास्टिक दीवार करने के लिए बाध्य किया जाता है, यह कोई अब समाधान में मापा जा सकता है) करने के लिए बाध्य है. हम कई अवरुद्ध शर्तों का परीक्षण किया है और पाया है कि अवरोधक कैसिइन (पियर्स) retinol प्रतिदीप्ति के इस nonspecific और रिसेप्टर स्वतंत्र गिरावट को कम करने में सबसे अधिक प्रभावी है. Retinol प्रतिदीप्ति के कृत्रिम गिरावट का एक अन्य स्रोत RBP की खराब गुणवत्ता है, के रूप में चर्चाऊपर.

STRA6 उत्प्रेरित retinol रिहाई, retinol loading और retinol परिवहन अपेक्षाकृत धीमी घटनाओं, के रूप में आंकड़े 2 और 3 में प्रतिनिधि डेटा में दिखाया गया हैं. प्रतिक्रियाओं अपेक्षाकृत धीमी गति से कर रहे हैं है क्योंकि प्रत्येक RBP केवल विटामिन के एक अणु एक और सभी STRA6 उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं दोनों RBP बाध्यकारी और RBP हदबंदी पर निर्भर करने के लिए जारी रखने के लिए बांध. के लिए STRA6 उत्प्रेरित retinol रिहाई प्रतिक्रिया के लिए जारी रखने के लिए, holo RBP APO RBP dissociates के बाद ही बाध्य कर सकते हैं. STRA6 उत्प्रेरित retinol लोड करने के लिए जारी रखने की प्रतिक्रिया के लिए, APO RBP holo-RBP dissociates के बाद ही बाध्य कर सकते हैं. सभी वास्तविक समय की निगरानी यहाँ वर्णित तकनीकों के लिए, हमने पाया है कि माप के आदर्श आवृत्ति एक माप हर 5 मिनट या 10 मिनट है. हालांकि अधिक लगातार माप उच्च अस्थायी समाधान बना सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डेटा फ़ाइलों को बहुत बड़ी हो सकती है क्योंकि हर समय बिंदु एक Excel फ़ाइल बनाता.

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चित्रा 1 शोधन HPLC पर RBP refolded holo RBP 100 retinol के साथ भरी हुई% प्राप्त. निकल राल - शुद्ध refolded RBP एक NaCl कदम ढाल (220 मिमी 10 मिनट, 360 मिमी 15 मिनट, और 1000 मिमी 15 मिनट) द्वारा आयन एक्सचेंज स्तंभ AX-300 के लिए लागू किया जाता है. सही ढंग से मुड़ा holo उनकी-RBP जारी है और 360 एनएम NaCl में eluted. सही ढंग से मुड़ा holo RBP इसी चोटियों के अवशोषण स्पेक्ट्रा (250 एनएम एनएम 400), RBP-1 misfolded RBP-2 misfolded, और प्रदूषण भी दिखाए जाते हैं (प्रोटीन चोटी एक नीले खड़ी रेखा ने संकेत दिया है और retinol शिखर संकेत दिया है खड़ी लाल रेखा). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2 STRA6 उत्प्रेरित APO RBP और holo-RBP से retinol रिलीज में retinol लोडिंग के वास्तविक समय की निगरानी. इस परख खुलासा STRA6 क्या खुद के द्वारा LRAT या के लिए कच्चे डेटा STRA6 catalzyed retinol loading और retinol रिलीज रूप में ओमेगा डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर दिखाया फ़ाइल का एक उदाहरण CRBP आइए बिना कर सकते हैं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. Retinol रिहाई प्रतिक्रिया आरंभ holo RBP STRA6 झिल्ली या 0 मिनट पर नियंत्रण झिल्ली को जोड़ा जाता है. Retinol लोडिंग प्रतिक्रिया आरंभ, में retinol STRA6 झिल्ली या नियंत्रण 0 मिनट पर APO - RBP साथ premixed झिल्ली के लिए जोड़ा गया है. 320 एनएम उत्तेजना और 460 एनएम उत्सर्जन प्रतिदीप्ति माप प्रतिक्रियाओं के समय पाठ्यक्रम का पता चला. 1 से 6 APO - RBP में निगरानी retinol loading प्रतिक्रियाओं (1, 3, और 5 STRA6 प्रतिक्रिया कर रहे हैं, 2, 4, और 6 नियंत्रण प्रतिक्रिया कर रहे हैं). 7 से 12 APO - RBP में निगरानी retinol loading (7, 9, और 11 प्रतिक्रियाओं STRA6 प्रतिक्रिया कर रहे हैं, 8, 10, और 12 नियंत्रण प्रतिक्रिया कर रहे हैं). बी प्रतिक्रियाओं के लिए अंतिम गणना की संकेतों ए में दिखाया बाएं ग्राफ 6 1 प्रतिक्रियाओं के आधार पर गणना की गई. सही ग्राफ 7 12 प्रतिक्रियाओं के आधार पर गणना की गई. उच्चतम प्रतिदीप्ति संकेत बाईं ग्राफ में 1 के रूप में परिभाषित किया गया है. holo-RBP की प्रतिदीप्ति 0 मिनट 1 के रूप में सही ग्राफ में परिभाषित किया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 में STRA6 उत्प्रेरित retinol परिवहन holo RBP से CRBP आइए वास्तविक समय निगरानी कच्चे डेटा फ़ाइल का एक उदाहरण है कि नज़र रखता है retinol और EGFP के बीच झल्लाहट के रूप में ओमेगा डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर दिखाया. 0 मिनट, holo RBP साथ STRA6 (1 प्रतिक्रियाओं, 3, और 5) झिल्ली या नियंत्रण झिल्ली युक्त प्रतिक्रियाओं के लिए जोड़ा जाता है EGFP-CRBPमैं प्रतिक्रियाओं (2 प्रतिक्रियाओं, 4 और 6) को आरंभ करने के लिए. 320 एनएम पर एक साथ द्वंद्वयुद्ध उत्तेजना के लिए उत्सर्जन माप 460-10 उत्सर्जन समय और 510-10 उत्सर्जन समय बेशक के रूप में नीले रंग का पता लगाने के पाठ्यक्रम के रूप में हरे रंग का पता लगाने का पता चला. अंतिम बी ए में दिखाया प्रतिक्रियाओं झल्लाहट संकेत को 3.6 कदम में तरीकों के अनुसार गणना की गई के लिए संकेतों की गणना झल्लाहट. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

हम यहाँ एक अनुकूलित RBP उत्पादन प्रोटोकॉल का हिस्सा है क्योंकि RBP उत्पादन और शोधन की प्रक्रिया सही ढंग से मुड़ा RBP पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. Misfolded RBP प्रजातियों और बैक्टीरियल प्रोटीन भी HPLC विशुद्ध में RBP बैक्टीरिया का उत्पादन की मात्रा का पता लगाने की उपस्थिति की संभावना को देखते हुए, यह सीरम से देशी RBP का उपयोग करने के लिए एक RBP से संबंधित निष्कर्ष की पुष्टि करने के लिए उपयोगी है. मूत्र RBP, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है APO RBP और 48,49 holo RBP सहित RBP की कई प्रजातियों का एक जटिल मिश्रण है.

वास्तविक समय की निगरानी यहाँ वर्णित तकनीकों retinol के आंतरिक प्रतिदीप्ति पर आधारित हैं. इन assays विकसित करने के लिए मूल प्रेरणा थी कि हम जानकारी है कि क्लासिक रेडियोधर्मी assays और HPLC आधारित assays के द्वारा प्रगट किया जा सकता द्वारा सीमित थे. उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि STRA6 थोड़ा विटामिन विटामिन ए तेज assays में खुद के द्वारा एक तेज गतिविधि है, लेकिन हम आसानी से एस के कम गतिविधि व्याख्या नहीं कर सकतेविटामिन में LRAT या 41 CRBP मैं बिना एक तेज TRA6. Retinyl एस्टर आधारित assays में, यह समझना आसान है कि स्वयं के द्वारा STRA6 retinyl एस्टर नहीं बना क्योंकि STRA6 एक एंजाइम है कि LRAT गतिविधि नहीं है. हालांकि, retinol आधारित assays में भी, STRA6 अभी भी खुद से थोड़ा गतिविधि है. क्या STRA6 किसी भी विटामिन सब पर एक तेज गतिविधि है? यदि यह नहीं है, CRBP मैं या LRAT कैसे अपनी गतिविधि को तेज कर सकते हैं? अगर यह होता है, यह CRBP मैं या LRAT की आवश्यकता क्यों है? हालांकि रेडियोधर्मी assays और assays HPLC आधारित इन सवालों का जवाब नहीं दिया, हम तर्क है कि STRA6 RBP से retinol रिलीज करने की क्षमता होनी चाहिए. हम यह भी तर्क है कि एक retinol प्रतिदीप्ति परख इस गतिविधि प्रकट हो सकता है. Retinol प्रतिदीप्ति माप यह वास्तविक 50,51 समय में दृश्य pigments के विरंजन प्रकाश के बाद संभव हड्डीवाला फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में मुक्त retinol के आंदोलन का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है. RBP रिसेप्टर गतिविधि retinol प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा नजर रखी जा सकता है? यह में खोज की थीकि retinol नाटकीय रूप से प्रतिदीप्ति बढ़ाया गया है जब 52,53 RBP बाध्य दो अनुसंधान समूहों द्वारा 1970 के दशक. हमने पाया है कि STRA6 उत्प्रेरित holo RBP से retinol रिलीज retinol प्रतिदीप्ति में कमी का कारण बनता है, जबकि STRA6 उत्प्रेरित APO RBP में retinol लोड हो रहा है retinol प्रतिदीप्ति में वृद्धि का कारण बनता है. हालांकि रेडियोधर्मी assays और HPLC आधारित assays बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है विटामिन ए तेज अध्ययन, प्रतिदीप्ति assays RBP रिसेप्टर गतिविधि हाल ही में जब तक अध्ययन करने के लिए, की संभावना नहीं किया गया है का इस्तेमाल किया था क्योंकि अंतर्जात रिसेप्टर के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया झिल्ली बहुत उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और retinoid बंधनकारी प्रोटीन / एंजाइमों का एक जटिल मिश्रण है कि यह मुश्किल व्याख्या करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन का योगदान करता है. वर्तमान में उपलब्ध संवेदनशील उपकरणों को भी क्या इन तकनीकों अधिक व्यावहारिक बनाने के. प्रतिदीप्ति माप को निर्देशित करने के लिए इसके अतिरिक्त, नई retinol EGFP युगपत द्वंद्वयुद्ध उत्सर्जन प्रकाशिकी के साथ 41 जोड़ी युग्मित झल्लाहटयह संभव retinol परिवहन का अध्ययन करने के लिए और वास्तविक समय में एक साथ कई प्रतिक्रियाओं में बंधनकारी प्रोटीन retinol बनाता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R01EY018144 के संस्थान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

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References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

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प्लाज्मा Retinol बाइंडिंग प्रोटीन की झिल्ली रिसेप्टर द्वारा वास्तविक समय Retinol परिवहन का विश्लेषण
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Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

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