JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

Published: January 28, 2013
doi:
10.3791/50169
, ,
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства высококачественных витаминов A / RBP комплекс и два мониторинга в реальном времени методы для изучения витамина транспорта STRA6, RBP рецепторов.

Abstract

Витамин А необходим для зрения и роста / дифференциации практически всех органов человека. Плазменные ретинол-связывающего белка (РСБ) является принципом и конкретным носителем витамина А в крови. Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства и очистки голо-RBP и два в реальном времени методы мониторинга для изучения транспорта витамина А на высокое сродство рецептора RBP STRA6. Первый метод позволяет производить большое количество высококачественного голо-RBP (100% загружены с ретинолом) витамина транспорта анализов. Высокое качество RBP имеет важное значение для функционального анализа, потому что неправильно свернутых RBP-релизы витамин А легко и бактериального загрязнения в подготовке RBP может привести к появлению артефактов. Мониторинг в реальном времени методы, как электрофизиологии внесли решающий вклад в исследования мембранного транспорта. RBP рецептор-опосредованного транспорта ретинола не были проанализированы в реальном времени до недавнего времени. Второй метод, описанный здесь, является причинамл-временной анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение или нагрузки. Третий способ в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP к сотовым ретинол связывающий белок I (CRBP-I). Эти технологии обеспечивают высокую чувствительность и разрешение при выявлении витамина RBP рецептора механизм усвоения.

Introduction

Витамин А является органической молекулой, которая необходима для выживания человека и надлежащее функционирование практически всех органов человека. Производные витамина А (ретиноиды) участвовать в разнообразных биохимических и клеточных событий, в том числе датчиков света за 1,2 видение и регуляции экспрессии генов и белков перевода во время эмбрионального развития и в тканях взрослого 3-6. Несмотря на то, ретинол обладает способностью диффундировать системно, эволюция придумала плазмы ретинол связывающий белок, специфический белок-носитель витамина транспорта в крови для достижения высокой эффективности и специфичности и, чтобы избежать токсичности, связанной со случайным диффузии 7-10. Высокое сродство рецептора, который связывается с ОДП и занимает витамин Была выдвинута гипотеза, в 1970-х годах 11-13. Несмотря на фактических данных, накопленных в течение трех десятилетий о существовании рецепторов RBP 14-31, рецептор гипотеза обсуждалась в течение многих лет из-за existencе неправильное определение голо-РСБ. Правильное определение голо-РСБ является то, что высокое сродство комплекса 1:1 между ретинолом и ОДП. Повторное извлечение голо-RBP органических растворителей необходимо производить апо-РСБ. Это определение используется почти во всех лабораториях изучения RBP 7,9,32-35 или рецептора RBP 14-31,36-42. Неверное определение голо-РСБ, который был использован, чтобы опровергнуть существование рецепторов КПБ является острая смесь свободного ретинола с апо-РСБ. Поскольку функция RBP рецептора витамина поглощения от голо-РСБ является освобождение ретинола от голо-РСБ, рецептор RBP будет играть никакой роли в ретинол поглощения, если ретинол является бесплатным для начала (как это было предложено неправильное определение голо -RBP).

Последнее определение RBP рецептора белка домена multitransmembrane называется STRA636 и его функции витамина поглощения от голо-RBP 36-43 решительно выступает против гипотезы, что RBP ненужно рецепторов для доставки витамина А. Подробный анализ показал, что STRA6 имеет 9 трансмембранных доменов с N-конца расположены внеклеточно и С-концом расположена внутриклеточно 40. Расположенный между трансмембранными 6 и 7 является одним из важнейших RBP связывающий домен 39. STRA6 соединен с обеих LRAT и CRBP-I в витамин А поглощение от голо-РСБ, но ни LRAT ни CRBP-я абсолютно необходима для повышения STRA6 деятельности 41. Способность STRA6 по активизации ретинол освобождение от голо-РСБ является ключом к ее поглощению витаминов деятельности 41. Опираясь на STRA6 выпустить свой ретинол, витамины доставки RBP может транспортировать витамин А к клеткам-мишеням в периферических тканях с высокой специфичностью и эффективностью.

Решающее значение голо-RBP определению и подготовке иллюстрируется не только исторические дебаты о существовании рецепторов КПБ, но и трех связанных с недавних работ на основе голо-RBP определения различотличный от оригинала и правильное определение 44-46. В первом документе использованы голо-RBP определение, которое было использовано для одобряют существование RBP рецепторов для изучения рецепторов RBP 44. Вторая и третья работы придумали третье определение голо-РСБ, что сделало его еще менее вероятно, для ретинола должны быть изучены, чтобы сформировать правильный комплекс с ОДП 45,46. Эти исследования подготовлены 3 H-retinol/RBP путем смешивания голо-RBP (даже не апо-РСБ) с 3 H-ретинол. С этого анализа не есть 3 H-retinol/RBP сформирован и не снять излишнее бесплатно 3 H-ретинол 45,46, это не тест для 3 H-ретинол поглощения от 3 ​​H-retinol/RBP, но это бесплатный 3 H-ретинол диффузии анализа. Было показано ранее, что STRA6 не увеличивает поглощение клетками свободного ретинола по LRAT 38 или CRBP-I 41. Практически все ретинола связана с ОДП в крови, и нет обнаруживаемых частотыэлектронной ретинола. Основной функцией рецептора RBP является ускорение ретинол освобождение от голо-РСБ во время ретинол поглощения от голо-RBP 41. Если ретинол искусственно выпустили или в свободной форме, чтобы начать с 45,46, рецептор RBP не нужен. Резко отличается от результатов, полученных свободной анализа диффузии ретинола по сравнению с анализы, основанные на правильно подготовленную голо-RBP показывают, что правильная подготовка RBP имеет решающее значение для его функционального анализа.

RBP может быть очищен из сыворотки крови человека 41, но процедура является сложной и низкая урожайность. Альтернативным подходом является создание RBP в E. палочки. Потому E. палочки не имеют возможности правильно сложить млекопитающих секретируемых белков с более чем одной парой дисульфидных связей, как RBP, важно, чтобы сложите RBP и очистить правильно сложить белка. Неправильно упакованных белков не только ведут себя иначе, исправлены сложенном RBP в различные анализы,но и привести к агрегации белков при хранении. По той же причине, апо-RBP производится только из высококачественных голо-РСБ. Мы описываем здесь оптимизированный протокол для получения высокого качества RBP загружены на 100% с ретинолом через бактериальные выражения, рефолдинг, и ВЭЖХ очистки. ВЭЖХ очистки не только удаляет неправильно сложил ОДП, но и значительное бактериальное загрязнение, которое может вызвать серьезные артефакты, если RBP используются в анализах сигнала. Мы также описывают два чувствительных мониторинга в реальном времени методы для изучения ретинол транспорта STRA6. Оба метода зависит от высокого качества RBP. Из-за ограниченности пространства, классические методы радиоактивного ретиноидов основе и ВЭЖХ на основе витамина А поглощение анализы не были описаны здесь.

Protocol

1. Производство, складывая и ВЭЖХ очистки Холо-RBP Преобразование BL-21cells с вектором рЕТ3а несущие кДНК человека RBP с 6-кратным теги Его на N-конце. Расти превращается BL-21 клеток в шейкере при 37 ° С в 40 мл LB среды с карбенициллин до OD при 600 нм достигает 0,5. Вызвать RBP экспрессии белка путем д…

Representative Results

Мы приведем здесь представитель результатов голо-RBP производства и очистки с помощью ВЭЖХ (рис. 1), в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение от голо-RBP и ретинола загрузки в апо-ОДП (рис. 2) и в режиме реального времени анализ STRA6 катализир…

Discussion

Мы разделяем здесь оптимизированный протокол производство ОДП, потому что RBP производства и очистки имеют решающее значение для создания правильно сложить ОДП. Учитывая возможность неправильно свернутых видов ОДП и наличие следовых количеств бактериальных белков даже в ВЭЖХ очищенн…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Поддержка Национального института здоровья грант R01EY018144.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S., Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. . The Retinoids. 2, 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey’s small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O’Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Retinol TransportPlasma Retinol Binding ProteinHolo-RBPSTRA6Real-time AnalysisElectrophysiologyCRBP-IVitamin A Transport Mechanism

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image