Vi presenterer robuste biokjemiske og mikroskopiske metoder for å studere<em> Caenorhabditis elegans</em> Lipid butikker. En rask, enkel, fikse-flekker prosedyre for fluoriserende oljedråpe avbildning utnytter spektrale egenskaper lipofile fargestoff Nile rød. Deretter presenterer vi biokjemiske måling av triglyserider og fosfolipider ved hjelp av fastfase ekstraksjon og gasskromatografi-massespektrometri.
Hvalkveisen C. elegans har dukket opp som en viktig modell for studiet av konserverte genetiske trasé som regulerer energiomsetningen som gjelder fedme hos mennesker og tilhørende sykdommer. Flere tidligere metoder utviklet for visualisering av C. elegans triglyserid-rike fett butikker har vist seg å være feilaktig, fremhever cellene enn lipid dråper. Andre metoder krever spesialisert utstyr, er tidkrevende, eller gi inkonsistente resultater. Vi introduserer en rask, reproduserbar, fiksativ-baserte Nile rød farging fremgangsmåte for nøyaktig og rask påvisning av nøytrale lipid dråper i C. elegans. En kort fiksering trinn i 40% isopropanol gjør dyrene helt permeable til Nile rødt, som deretter brukes til å flekke dyr. Spektrale egenskaper av denne lipofil fargestoff la den sterkt og selektivt fluoresce i den gulgrønne spektrum bare når i en lipid-rikt miljø, men ikke i merpolare miljøer. Dermed kan lipid dråper bli visualisert på en fluorescerende mikroskop utstyrt med enkle GFP imaging evne etter bare en kort Nile rød farging trinn i isopropanol. Hastighet, kostnader og reproduserbarhet av denne protokollen gjør den ideell for høy gjennomstrømming skjermer. Vi viser også en sammenkoblet fremgangsmåte for biokjemisk bestemmelse av triglyserider og fosfolipider ved hjelp av gasskromatografi-masse spektrometri. Dette strengere protokollen bør brukes som en bekreftelse på resultatene fra Nilen rød mikroskopiske lipid besluttsomhet. Vi forventer at disse teknikkene vil bli nye standarder innen C. elegans metabolsk forskning.
Bevaring av metabolske veier mellom mennesker og nematode Caenorhabditis elegans gjør det et kraftig modell organisme for studiet av fedme. Mens C. har elegans ikke har adipocytter dedikert til fettlagring som i pattedyr, de store triglyserider i lipid dråper 1 og har mange av de samme regulatorer av fettlagring og energibruk 2,3. Til analysen for fett nivåer i C. elegans, har flere metoder blitt foreslått med varierende grad av letthet og suksess. Den en gang så vanlige bruken av fluorescerende, vitale fargestoffer 4-7 ble nylig kalt inn spørsmålet, og disse reagensene viste seg å være flekker en kupé distinkt fra de viktigste fett lagring depot av C. elegans 1,8-11. Fiksativ-baserte non-fluorescerende fargestoffer, som for eksempel Sudan svart og Olje-red-O, mens vellykket på å fremheve lipid dråper i ormen 12-14, ikke har så stor dynamisk rekkevidde for kvantifisering som fluorescerendecent fargestoffer 8,13,15. Videre dagens metoder for fiksering for både fluorescerende og ikke-fluorescerende fargestoffer er tidkrevende og involverer flere fryse-tine trinn og / eller bruk av giftige kjemikalier 1,9,10. Bruk av spesifikke BODIPY-merkede lipid analogene har blitt rapportert å utheve lipid dråper når matet til levende ormer med kortsiktig merking 15. Men dette er avhengig opptak av fargestoff, og er derfor forspent av C. elegans håndtering og metabolisme av BODIPY fettsyre-analoger. En etablert alternativ til lipid-flekker fargestoffer er label-fri, sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) eller stimulert Raman spredning (SRS) mikroskopi, som tar seg av de karakteristiske vibrasjonen egenskaper lipidmolekylene å visualisere fete butikker 10,16, 17. Imidlertid, er dyrt spesialutstyr er nødvendig for denne fremgangsmåte, og gjennomstrømning er lav i beste fall.
Å oppfylle et behov for rask og skalerbar analysersis av nøytrale lipid butikker i C. elegans metabolsk forskning, introduserer vi en ny, svært reproduserbar metode for fiksativ-baserte Nile rød lipid farging. Spektral og fysikalsk-kjemiske egenskaper av den lipofile fargestoff Nile rød indusere en gul-gull-spektral forskyvning i sin eksitasjon-emisjonstopp, slik at det til å fluorescere i grønn emisjonsspektrum bare når i en lipid-rikt miljø, men ikke i mer polare miljøer 18 , 19. Således lipid dråper kan oppdages etter enkel farging ved bruk av en grønn fluorescerende protein (GFP) filter satt for fluorescens mikroskopi. Den enkle og kostnader i denne teknikken gjør den ideell for høy gjennomstrømming skjermer. Vi viser også en sammenkoblet, streng metode for biokjemisk bestemmelse av triglyserider og fosfolipider ved hjelp av fastfase ekstraksjon og gasskromatografi-massespektrometri. Biokjemiske lipid måling korrelerer med Nile rød-baserte mikroskopisk bestemmelse av C. elegans fat masse, og bør brukes som en bekreftelse på funnene laget med mikroskopisk lipid bestemmelse.
Den presenterte Protokollen tillater hurtig, storskala screening av lipidnivåer i C. elegans, som lett kan tilpasses høy gjennomstrømning skjermer. I motsetning til tidligere brukte metoder, som innebærer en lang fiksering skritt i paraformaldehyd etterfulgt av flere fryse-tine sykluser 8,10, krever vår protokoll en enkel 3-min fiksering i isopropanol. Vi har funnet at ved å farge C. elegans i 40% isopropanol, blir de fritt gjennomtrengelig for Nile rødt, uten bruk av ytterligere fryse-tine eller fiksering trinnene. Også, som Nile rød selektivt fluorescerer i hydrofobe oppbevaringsrom i grønne spektrum 18,19,31, er ingen destaining nødvendig. Totalt, kan dyr bli tatt fra RNAi platene til farget og klar til å ta bilder dyr i overkant 2,5 hr. Denne metoden kan utføres relativt billig og med høy reproduserbarhet. Metoden avhenger ikke evnen av C. elegans til opptak eller konsentratfargestoff, og derfor ikke har de samme begrensninger som fôring baserte metoder ved hjelp av vitale fargestoffer. Gitt reproduserbarhet og presisjon av målinger, er metoden egnet for screening stort antall genet inactivations etter RNAi. Hvis kvantifisering av lipid nivåer er ønskelig basert på fiksativ Nile rød flekker, anbefaler vi bruk på 4-6 biologiske replikater med de riktige kontrollene og statistisk testing brukes.
Det er sannsynlig at mange gener inactivations fører til små dyr (på grunn av RNAi kloner forårsaker forsinket eller arrestert utvikling) vil komme ut av en skjerm for fett regulatorer, uavhengig av tilknytning til energiomsetningen. Mens bildeanalyse programmet vi utnyttet står for ormer i forskjellige størrelser ved å normalisere fluorescensintensiteten til ormen området, kan enkelte forskere ønsker også å vurdere å sammenligne fett flekker nivåer av små dyr med villtype dyr av en lignende utviklingsstadiet. IVed små eller utviklingshemmede arrestert dyr med tilsynelatende lav fettmasse, foreslår vi at ingen enkelt modalitet er tilstrekkelig til å demonstrere endret lipidmetabolismen. Flere oppfølgingseksperimenter inkludert SPE-GCMS, kan være nødvendig for å fastslå den lipid-regulerende funksjon av disse genene. For kjent metabolsk regulator fasn-1, SPE-GCMS analyse i forhold til utviklingshemmede matchet N2 L2 kontroll dyr var nødvendig for å bekrefte den tilsynelatende lite fett fenotype funnet når sammenlignet med voksne kontroll dyr. Mens Nile rød fett flekker indikert lavere fettinnhold i forhold til å kontrollere voksen RNAi, sammenlignet med scene-matchet L2 kontroll RNAi dyr, ble ingen åpenbar forskjell sett. Følgelig, bruk av en annen metode, ble dvs. biokjemiske kvantifisering av TAG / PL ratio er nødvendig for å fastslå at fasn-1 er en sann regulator av fettmasse, som fasn-1 RNAi er biokjemisk skjelnes fra scenen matchet L2 kontroll RNAi dyr.
<p class = "jove_content"> Selv om vi presenterer bildebehandling og behandling for en high-throughput plattform, kan en konvensjonell oppreist mikroskop lett brukes til å ta bilder fra ormer montert på agarose pads 20 eller på konvensjonelle størrelse Teflon-trykt 8-12 vel mikroskopobjektglass . Den eneste begrensningen er at som den grønne fluorescens av lipid dråper farget med Nile røde photobleaches raskt, systematiske, ensartede eksponeringsforhold må brukes til å sikre sammenlignbarhet mellom bildene. Vi finner at en helautomatisk mikroskop med ensartede bildetakingsenheter forhold fungerer best om dette.En av de store styrkene til denne protokollen er at etter bildene er samlet de kan lagres for fremtidig re-analyse. Samme bilder kunne brukes til å bestemme kroppsstørrelse i tillegg til fettinnhold. Videre, ettersom beregningsorientert programmer blir mer avansert, er utsiktene for enkelt ormen analyse, genererer statistisk signifikante resultaterfra en enkelt brønn. Dermed vår metode som benytter high-throughput mikroskopi har noen fordeler fremfor publiserte skjermen metoder som bruker en Copas Biosort å kvantifisere fluorescerende signaler 32,33. Men de metoder er definitivt gratis.
Presis, biokjemisk bestemmelse av fettinnhold av SPE og GC / MS bekrefter Nilen rød flekker av de store fete butikker i C. elegans. Selv om det absolutte kvantifisering oppnådd fra fiksativ Nile rød flekker og biokjemiske lipid besluttsomhet ofte ikke matche perfekt, begge metodene produsere svært reproduserbare, statistisk signifikante resultater som samtykker kvalitativt. I tillegg kan denne metoden være skreddersydd for å møte de spesielle behovene til den enkelte forsker som kan kreve ytterligere analyse av de enkelte klasser av glykosfingolipider, fosfolipider, eller triglyserider er tilstede i forskjellige prøver. Det bør bemerkes at andre grupper har brukt teknologi andre than SPE å skille lipidklasser før GC / MS 22. Tynnsjiktskromatografi (TLC) og høytrykks væske-kromatografi (HPLC) har fordeler fremfor SPE i at de kan være i stand til å bedre separate distinkte nøytrale lipider (f.eks Tag, diacylglyceroler, frie fettsyrer, og kolesterolestere) fra polare lipider (fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin) og glykol-sphingolipids. Vi velger SPE fordi det krever et minimum av utgangsmaterialet (2,500-5,000 ormer), understreker det store langsiktige energi butikker, tags, som utgjør mesteparten av den nøytrale lipidfraksjonen 4, og er rask, krever ingen spesialisert utstyr eller platene. Det bør understrekes at basert på standard blandinger, skiller SPE helt koder fra PL, og er reproduserbar og pålitelig (se figur 5A). Mens quantitation og analyse av fettsyremetylestere trenger en GC / MS, er dette utstyret allment tilgjengelig, og hvis ikke lokalt, prøver kanbli generert som ovenfor og lagret ved -80 ° C under nitrogen inntil analyse av en samarbeidspartner eller kommersielle GC / MS-tjenesten er anordnet.
Den GCMS utgang inneholder høyoppløselige data på hver fettsyre innen hver lipid arter. Dette tillater bestemmelse av detaljerte forskjeller mellom prøver sammenlignet. Som et eksempel, kunne undersøkeren avgjøre om nivåene av visse fettsyrer ble endret i overflod mer betydelig enn andre i DAF-2, lpd-3 eller fasn-1 RNAi versus vektorkontroll. Dette enormt kraftig verktøy kan derfor gi detaljert informasjon om hvilke lipid arter endres i overflod med noen eksperimentelle manipulasjon.
For vår analyse, vi oftest normalisere TAG masse til PL masse. Mens protein eller DNA kan også bli brukt til å normalisere lipid massen etter bestemmelse fra en aliquot av sonikert ormen pellet, finner vi at disse metodene forutsetter introduced menneskelige feil i alle pipetteringsutstyr trinn og i prøve utvinning fra hver utvinning. Det er av denne grunn at vi valgte å i stedet bruke PL masse som vår normalisering faktor. Unaturlige standarder innføres ved starten av protokollen (tritridecanoin for TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) for PL) føres gjennom alle trinnene av fastfase ekstraksjon og FAME forberedelse, og garanterer kvantitativ og representativ utvinning av både TAG og PL fraksjoner. Samme garanti kan ikke gjøres dersom etterforskerne bruke protein eller DNA å normalisere TAG masse. Vi tror PL for å være den mest robuste måleren som å sammenligne TAG nivåer over prøvene, som det tidligere har vært vist at PL bare minuttbasis endret av samme stimulans bevirke stor masse skift i TAG nivåer, f.eks utvidet sult eller økt mosjon 34 – 36. PL er tenkt å spille en strukturell rolle, sikre membran flyt og mobilnettet integrity og signalering roller snarere enn som energilager 37-39. I våre hender, TAG / PL ratio ligner mest det som oppnås ved fiksativ-baserte lipid farging med Nile rødt, og er enig med det som ble funnet av andre grupper 21. En alternativ strategi er brukt av Watts laboratoriet, hvor andelen av lipid TAG beregnes versus totale lipider 9,22,29.
Bruken av ikke-innfødte typer TAG og PL standard garanterer at ingen innfødte fettsyrer vil bli inkludert i normalisering beregningen. Valget av kjedelengde er utelukkende basert på behovet av disse standardene for å ikke forstyrre den massespektra av innfødte fettsyrer. Vi har funnet at fettsyrer av 13:00 og 17:00 tjener best for dette formål. Det er mulig, gitt de forskjellige kjemiske egenskaper kortere fettsyrer, at våre unaturlige fettsyre standarder ikke kan være representativ for gjenvinning av alle kjedelengde fettsyrer eller kjeder med different metning indekser. Således er det mulig at i løpet SPE eller GCMS kan vi se forskjeller i effektiviteten av rensing eller påvisning mellom lipider av forskjellige kjedelengder. Basert på dette og annen ionisering av forskjellige fettsyrer i GCMS, er det ikke mulig å foreta en absolutt uttalelse om overflod av enhver fettsyre. Derfor har vi bare sammenligne mellom prøvene innenfor ett enkelt eksperiment abundances av enhver fatty acid. Hvis man ønsker å absolutt kvantifisere en fettsyre, en måte dette kan oppnås er å kjøre en prøve fremstilt som ovenfor tilsatt en kjent mengde av en stabilt isotopically merket 13 C versjon av det eller lignende fettsyre, slik at det kunne være skilles basert på massen til den ion i MSD, for eksempel. Gitt at vi bare sammenligne relative mengder lipidklasser eller enhver fettsyrer, vår 13:00 TAG og 17:00 PL standarder tjene dette formålet tilstrekkelig, på et minimum av kostnader, for åsikre tilstrekkelig og representativt utvinning av hver lipid klasse.
Til dette punktet, har det vært en mangel på konsensus om tolkningen av visse resultater erholdt ved forskjellige metoder, og i hvilken de rådende metoder bør være. Samlet det bør bemerkes at ingen metode isolert er ideell for å studere fettstoffskiftet i C. elegans. Men ved å bruke flere screening og validering modaliteter, kan man oppnå tillit data fremskaffet på lipid regulatoriske gener. Dermed vil vi for vår protokoll for å tjene som en målestokk for det videre arbeidet innen C. elegans fett forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Michael Kacergis for teknisk bistand og Lianfeng Wu for diskusjoner og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en karriereutvikling pris fra NIH / NIDDK (K08DK087941 til AAS), en NIH / NIDDK trening stipend (5T32DK007028 til ECP), den Ellison Medical Foundation New Scholar i Aldring Award (til AAS), og Charles H . Hood Foundation Child Health Research Award (til AAS).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |