हम अध्ययन के लिए मजबूत जैव रासायनिक और सूक्ष्म तरीके प्रस्तुत<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em> लिपिड भंडार. फ्लोरोसेंट लिपिड छोटी बूंद इमेजिंग के लिए एक तेजी से, सरल, प्रक्रिया फिक्सिंग धुंधला lipophilic डाई नील लाल वर्णक्रमीय गुणों का लाभ उठाता है. हम तो ट्राइग्लिसराइड्स और ठोस चरण निष्कर्षण और गैस क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग phospholipids के जैव रासायनिक माप उपस्थित थे.
निमेटोड सी. एलिगेंस संरक्षित आनुवंशिक वसा के चयापचय को विनियमित करने के रूप में यह मानव मोटापा और उसके संबंधित विकृतियों संबंधित रास्ते के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल के रूप में उभरा है. पिछले कई सी. के दृश्य के लिए विकसित के तरीके एलिगेंस ट्राइग्लिसराइड अमीर मोटी दुकानों को गलत हो सकता है, सेलुलर लिपिड बूंदों के अलावा अन्य डिब्बों को उजागर करने के लिए सिद्ध कर दिया है. अन्य विधियों विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, समय लेने वाली हैं, या असंगत परिणाम निकलेगा. हम सी. में तटस्थ लिपिड बूंदों के सही और तेजी से पता लगाने के लिए तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, लगानेवाला आधारित नील लाल धुंधला विधि परिचय एलिगेंस. 40% isopropanol में एक छोटी नियतन कदम पूरी तरह से नील लाल, है जो फिर जानवरों दाग के लिए प्रयोग किया जाता है पारगम्य जानवरों बनाता है. इस lipophilic डाई के वर्णक्रमीय गुण यह दृढ़ता और चुनिंदा स्पेक्ट्रम पीले, हरे प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति देते हैं लिपिड युक्त वातावरण में ही है, लेकिन अधिक नहीं जबध्रुवीय वातावरण. इस प्रकार, लिपिड बूंदों केवल एक संक्षिप्त isopropanol में नील लाल धुंधला हो जाना कदम के बाद एक फ्लोरोसेंट सरल GFP इमेजिंग क्षमता के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर देखे जा सकते हैं. गति, सामर्थ्य, और इस प्रोटोकॉल के reproducibility यह आदर्श उच्च throughput स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं. हम भी ट्राइग्लिसराइड्स और गैस क्रोमैटोग्राफी जन – स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर phospholipids के जैव रासायनिक निर्धारण के लिए एक जोड़ी विधि प्रदर्शित करता है. यह अधिक कठोर प्रोटोकॉल नील लाल सूक्ष्म लिपिड दृढ़ संकल्प से प्राप्त परिणामों की पुष्टि के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम आशा करते हैं कि इन तकनीकों नए मानकों सी. के क्षेत्र में हो जाएगा एलिगेंस चयापचय अनुसंधान.
मनुष्य और निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस के बीच चयापचय मार्ग के संरक्षण यह मोटापे के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाता है. जबकि सी. एलिगेंस adipocytes स्तनधारियों में की तरह वसा भंडारण के लिए समर्पित नहीं है, वे दुकान ट्राइग्लिसराइड्स लिपिड बूंदों 1 में करते हैं और वसा भंडारण और ऊर्जा का उपयोग करें 2,3 की एक ही नियामकों के कई अधिकारी. सी. में वसा के स्तर के लिए परख एलिगेंस, कई तरीकों आसानी और सफलता के स्तर पर अलग से एक प्रस्ताव किया गया है. फ्लोरोसेंट, महत्वपूर्ण 4-7 रंगों के एक बार आम उपयोग हाल ही में प्रश्न में बुलाया गया था, और इन अभिकर्मकों एक मुख्य सी. वसा भंडारण डिपो से अलग डिब्बे धुंधला हो साबित कर दिया 1,8-11 एलिगेंस. लगानेवाला आधारित सूडान काला और तेल लाल O जैसे गैर फ्लोरोसेंट रंजक, जबकि 12-14 कीड़ा में लिपिड बूंदों को उजागर करने में सफल है, एक बड़े गतिशील रेंज fluores रूप quantitation के लिए नहीं हैप्रतिशत 8,13,15 रंजक. इसके अलावा, दोनों फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट रंगों के लिए निर्धारण के मौजूदा तरीकों समय लेने वाली हैं और कई कदम फ्रीज पिघलना और / या विषाक्त 1,9,10 रसायनों के उपयोग शामिल है. विशिष्ट BODIPY लेबल लिपिड analogs का उपयोग करने के लिए लिपिड बूंदों को उजागर जब अल्पकालिक 15 लेबल के साथ रहने वाले कीड़े खिलाया करने के लिए सूचित किया गया है. हालांकि इस डाई तेज पर निर्भर करता है और इसलिए सी. द्वारा पक्षपातपूर्ण एलिगेंस और BODIPY फैटी एसिड analogs की हैंडलिंग चयापचय. एक स्थापित लिपिड धुंधला रंगों के लिए वैकल्पिक लेबल मुक्त, सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन (कार) बिखरने या उत्तेजित रमन (एसआरएस) के बिखरने माइक्रोस्कोपी, जो लिपिड अणु की विशेषता कंपन गुणों का लाभ लेने के लिए मोटी दुकानों 10,16 कल्पना है, 17. हालांकि, इस विधि के लिए महंगी विशेष उपकरणों के लिए आवश्यक है, और throughput में सबसे कम है.
तेजी से, स्केलेबल analy के लिए एक की जरूरत को पूरातटस्थ लिपिड दुकानों के सी. में सीस एलिगेंस चयापचय अनुसंधान, हम एक उपन्यास परिचय, लगानेवाला आधारित नील लाल लिपिड धुंधला हो जाना अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि. Lipophilic डाई नील लाल वर्णक्रमीय और भौतिक गुणों अपने चरम उत्तेजना उत्सर्जन में एक बदलाव पीले सोने वर्णक्रमीय प्रेरित, यह हरी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में केवल जब एक लिपिड युक्त वातावरण में नहीं है, लेकिन अधिक ध्रुवीय 18 वातावरण में प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति देता है 19. इस प्रकार लिपिड बूंदों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए निर्धारित एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन फिल्टर (GFP) के उपयोग के द्वारा सरल धुंधला हो जाना के बाद पता लगाया जा सकता है. आसानी और इस तकनीक का सामर्थ्य यह आदर्श उच्च throughput स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं. हम भी एक जोड़ी, ट्राइग्लिसराइड्स और ठोस चरण निष्कर्षण और गैस क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग phospholipids के जैव रासायनिक दृढ़ संकल्प के लिए कठोर विधि प्रदर्शित करता है. बायोकेमिकल लिपिड माप लाल आधारित नील सी. सूक्ष्म दृढ़ संकल्प के साथ संबद्ध है एलिगेंस पिताटी, और बड़े पैमाने पर सूक्ष्म लिपिड दृढ़ संकल्प के साथ किए गए निष्कर्षों की पुष्टि के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल तेजी से, सी. में लिपिड स्तर के बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है एलिगेंस, जो आसानी से उच्च throughput स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. पहले तरीकों का इस्तेमाल किया है, जो कई फ्रीज पिघलना 8,10 चक्र द्वारा पीछा paraformaldehyde में एक लंबा नियतन कदम शामिल के विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल isopropanol में एक सरल नियतन 3 मिनट की आवश्यकता है. हमने पाया है कि सी. धुंधला 40% isopropanol में एलिगेंस, वे स्वतंत्र रूप से नील लाल पारगम्य अतिरिक्त कदम फ्रीज पिघलना या निर्धारण के उपयोग के बिना हो गया है. इसके अलावा, के रूप में नील लाल चुनिंदा हरी 18,19,31 स्पेक्ट्रम में hydrophobic डिब्बों में fluoresces, कोई destaining आवश्यक है. कुल में, जानवरों आरएनएआई प्लेटों से दाग और करने के लिए तैयार छवि जानवरों के लिए किया जा सकता है बस पर 2.5 घंटा लिया. इस विधि अपेक्षाकृत सस्ते और उच्च reproducibility के साथ किया जा सकता है. विधि सी. की क्षमता पर निर्भर नहीं करता है तेज या ध्यान केंद्रित करने के लिए एलिगेंसडाई और इसलिए आधारित महत्वपूर्ण रंजक तरीकों का उपयोग कर खिलाने के रूप में एक ही सीमाओं नहीं है. Reproducibility और माप की शुद्धता को देखते हुए, विधि आरएनएआई द्वारा जीन inactivations की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है. लिपिड स्तर के quantitation लगानेवाला नील लाल धुंधला हो के आधार पर वांछित है, हम 4-6 के उपयोग के उचित नियंत्रण और सांख्यिकीय लागू परीक्षण के साथ जैविक replicates की सलाह देते हैं.
यह संभावना है कि कई छोटे जानवरों के लिए प्रमुख जीन inactivations (देरी या गिरफ्तार विकास के कारण आरएनएआई क्लोनों के कारण) वसा नियामकों के लिए एक स्क्रीन के बाहर आते हैं, वसा के चयापचय से किसी भी संबंध की परवाह किए बिना होता है. छवि विश्लेषण कार्यक्रम जबकि हम कीड़ा क्षेत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्य से विभिन्न आकार के कीड़े के लिए खातों का उपयोग, व्यक्तिगत शोधकर्ताओं ने यह भी एक समान विकास मंच के जंगली जानवरों के लिए छोटे जानवरों की चर्बी धुंधला हो जाना के स्तर की तुलना करने पर विचार करना चाहते हो सकता है. मेंस्पष्ट कम वसा द्रव्यमान के साथ छोटे या developmentally गिरफ्तार कर लिया जानवरों के मामले में, हम बताते हैं कि कोई भी साधन बदल लिपिड चयापचय को प्रदर्शित करने के लिए पर्याप्त है. विशेष GCMS सहित कई पालन प्रयोगों, इन जीनों के समारोह लिपिड नियामक का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है. जाना चयापचय नियामक के लिए एक FASN, विशेष GCMS विश्लेषण developmentally मिलान N2 L2 नियंत्रण पशुओं की तुलना में स्पष्ट कम वसा पाया जब वयस्क नियंत्रण जानवरों के लिए तुलना phenotype की पुष्टि के लिए आवश्यक था. जबकि नील लाल वसा धुंधला हो कम वसा रिश्तेदार का स्तर संकेत वयस्क आरएनएआई, जब मंच मिलान L2 नियंत्रण आरएनएआई जानवरों की तुलना में नियंत्रित करने के लिए कोई स्पष्ट अंतर देखा गया था. तदनुसार, एक दूसरी विधि का उपयोग करते हैं, यानी अनुपात / टैग PL के जैव रासायनिक मात्रा का ठहराव आवश्यक निर्धारित करने के लिए किया गया था कि FASN-1 वसा द्रव्यमान का एक सच्चे नियामक है, FASN-1 के रूप में आरएनएआई biochemically चरण मिलान L2 नियंत्रण आरएनएआई जानवरों से अलग पहचाना है.
<p cलड़की = "jove_content"> जब तक हम और उच्च throughput मंच के लिए इमेजिंग प्रसंस्करण मौजूद है, एक पारंपरिक ईमानदार माइक्रोस्कोप आसानी agarose पैड पर 20 या पारंपरिक Teflon मुद्रित आकार पर घुड़सवार कीड़े से छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 8 12 अच्छी तरह से खुर्दबीन स्लाइड . केवल सीमा यह है कि लिपिड नील लाल photobleaches के साथ दाग जल्दी बूंदों की हरी प्रतिदीप्ति के रूप में, व्यवस्थित, वर्दी जोखिम शर्तों छवियों के बीच तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम पाते हैं कि वर्दी छवि अधिग्रहण शर्तों के साथ एक पूरी तरह से स्वचालित खुर्दबीन इस प्रभाव के लिए सबसे अच्छा काम करता है.इस प्रोटोकॉल के महान शक्तियों में से एक यह है कि छवियों को एकत्र कर रहे हैं के बाद वे फिर से विश्लेषण भविष्य के लिए बचाया जा सकता है. एक ही छवियों वसा सामग्री के अलावा शरीर के आकार का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, कम्प्यूटेशनल कार्यक्रमों के रूप में और अधिक उन्नत हो, वहाँ एक कीड़ा विश्लेषण के लिए संभावना है, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम पैदाएक ही अच्छी तरह से. इस प्रकार हमारे तरीका है कि उच्च throughput माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल प्रकाशित स्क्रीन तरीके में है कि एक Copas Biosort उपयोग फ्लोरोसेंट संकेत 32,33 मात्रा ठहराना पर कुछ फायदे हैं. हालांकि, के तरीके में निश्चित रूप से पूरक हैं.
सटीक, SPE और जीसी / एमएस द्वारा लिपिड सामग्री के जैव रासायनिक निर्धारण सी. में प्रमुख मोटी दुकानों के नील लाल धुंधला हो की पुष्टि एलिगेंस. हालांकि पूर्ण लगानेवाला नील लाल धुंधला हो जाना और जैव रासायनिक लिपिड दृढ़ संकल्प से हासिल quantitation अक्सर पूरी तरह से मेल नहीं खाते, दोनों तरीकों अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम है कि गुणात्मक सहमत हूँ उत्पादन. इसके अलावा, इस विधि के लिए व्यक्तिगत शोधकर्ताओं की विशिष्ट आवश्यकताओं जो glycosphingolipids, phospholipids, या विभिन्न नमूनों में मौजूद ट्राइग्लिसराइड्स के अलग – अलग वर्गों के आगे के विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है को पूरा करने के लिए सिलवाया जा सकता है. ऐसा लगता है कि अन्य समूहों प्रौद्योगिकी अन्य था इस्तेमाल किया जाना चाहिएn SPE लिपिड जीसी / एमएस 22 पहले वर्गों को अलग करने के लिए. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) SPE से अधिक लाभ है कि वे बेहतर अलग ध्रुवीय lipids से अलग तटस्थ lipids (जैसे टैग diacylglycerols, मुक्त फैटी एसिड, और कोलेस्ट्रॉल एस्टर) करने में सक्षम हो सकता है (phosphatidylcholine है, ) phosphatidylethanolamine और glycol – sphingolipids. हम SPE चुन क्योंकि यह सामग्री (2,500-5,000 कीड़े) शुरू करने की एक न्यूनतम आवश्यकता है, यह प्रमुख लंबी अवधि के ऊर्जा भंडार, टैग, जो तटस्थ लिपिड 4 अंश के सबसे बनाने पर जोर देती है, और तेजी से है, कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है या प्लेटें. बात पर बल दिया जा सकता है कि मानक के मिश्रण पर आधारित होना चाहिए, SPE पूरी तरह से pls से टैग अलग, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है (चित्रा 5A देखें). जबकि quantitation और फैटी एसिड मिथाइल esters के विश्लेषण एक जीसी / एमएस की आवश्यकता है, इस उपकरण सामान्य रूप से उपलब्ध है, और यदि नहीं, स्थानीय नमूने हो सकता हैइसके बाद के संस्करण के रूप में उत्पन्न और -80 डिग्री नाइट्रोजन के अंतर्गत सी संग्रहीत जब तक एक सहयोगी या वाणिज्यिक जीसी / एमएस सेवा द्वारा विश्लेषण की व्यवस्था है.
GCMS उत्पादन प्रत्येक लिपिड प्रजाति के भीतर प्रत्येक फैटी एसिड पर उच्च संकल्प डेटा शामिल हैं. यह तुलना में नमूने के बीच विस्तृत मतभेद के निर्धारण की. एक उदाहरण के रूप में, अन्वेषक का निर्धारण कर सकता है कि क्या कुछ फैटी एसिड का स्तर बहुतायत में बदल रहे थे daf-2, lpd-3 या FASN 1 आरएनएआई बनाम वेक्टर नियंत्रण में दूसरों की तुलना में काफी अधिक है. इसलिए यह अत्यधिक शक्तिशाली उपकरण में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं जिस पर लिपिड प्रजातियां बहुतायत में किसी भी प्रयोगात्मक हेरफेर के साथ बदल रहे हैं.
हमारे विश्लेषण के लिए, हम सबसे अधिक बार टैग PL बड़े पैमाने पर करने के लिए बड़े पैमाने पर मानक के अनुसार. जबकि प्रोटीन या डीएनए भी sonicated कीड़ा गोली की अशेष भाजक से निर्धारण के बाद लिपिड जन सामान्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तो हम पाते हैं कि इन तरीकों int अधीन हैंसभी pipetting चरणों के दौरान और प्रत्येक निष्कर्षण से नमूना वसूली में roduced मानव त्रुटि. यह इस कारण है कि हम करने के बजाय हमारे सामान्य कारक के रूप में PL जन का उपयोग करने के लिए चुना है. अप्राकृतिक मानकों (टैग के लिए tritridecanoin, पी एल के लिए 1,2 diheptadecanoyl एस.एन. ग्लिसरो तीन phospho (1'आरएसी – ग्लिसरॉल)) प्रोटोकॉल के शुरू में पेश कर रहे हैं ठोस चरण निष्कर्षण के सभी चरणों के माध्यम से किया जाता है और प्रसिद्धि तैयारी, और दोनों टैग और PL fractions के मात्रात्मक और प्रतिनिधि वसूली की गारंटी. एक ही गारंटी अगर जांचकर्ताओं प्रोटीन या डीएनए का उपयोग टैग जन सामान्य नहीं किया जा सकता है. हम PL जिसके द्वारा नमूने भर TAG स्तर की तुलना करने के लिए सबसे मजबूत गेज होने के लिए विश्वास है, के रूप में यह पहले से दिखाया गया है कि PL प्रतिमिनट केवल एक ही TAG स्तर, जैसे विस्तारित भुखमरी में बड़े बड़े पैमाने पर बदलाव का प्रभावशाली उत्तेजना द्वारा बदल दिया है या 34 व्यायाम बढ़ – 36. PL एक संरचनात्मक भूमिका निभा लगा रहे हैं, झिल्ली तरलता और सेलुलर inte सुनिश्चित करनेgrity और 37-39 भंडारण ऊर्जा के रूप में बजाय संकेत भूमिका. हमारे हाथ में, टैग / PL अनुपात सबसे अधिक बारीकी से मेल खाती है क्या लगानेवाला आधारित नील लाल के साथ लिपिड धुंधला हो जाना द्वारा प्राप्त की है, और 21 अन्य समूहों द्वारा पाया गया कि के साथ सहमत. एक वैकल्पिक रणनीति वत्स प्रयोगशाला, जहां लिपिड टैग का प्रतिशत कुल 9,22,29 lipids बनाम गणना की है के द्वारा किया जाता है.
टैग और पी एल मानक के गैर देशी प्रकार के उपयोग सुनिश्चित करता है कि कोई देशी फैटी एसिड सामान्यीकरण गणना में शामिल किया जाएगा. श्रृंखला लंबाई का चयन विशुद्ध रूप से देशी फैटी एसिड की जन स्पेक्ट्रा के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए इन मानकों की जरूरत पर आधारित है. हमने पाया है कि इस उद्देश्य के लिए 13:00 और 17:00 के फैटी एसिड की सेवा सबसे अच्छा है. यह संभव है, कम श्रृंखला फैटी एसिड के विभिन्न रासायनिक गुणों को देखते हुए, कि हमारे अप्राकृतिक फैटी एसिड मानकों सभी श्रृंखला लंबाई फैटी एसिड या diff के साथ श्रृंखला की वसूली के प्रतिनिधि नहीं हो सकताerent संतृप्ति सूचकांक. इस प्रकार यह संभव है कि SPE या GCMS दौरान हम या शुद्धि विभिन्न श्रृंखला लंबाई के lipids के बीच पता लगाने की क्षमता में अंतर देख सकते हैं. इस और GCMS में विभिन्न फैटी एसिड के विभिन्न ionization पर आधारित है, यह संभव है किसी भी फैटी एसिड की बहुतायत के बारे में एक निरपेक्ष बयान करना नहीं है. इसलिए, हम केवल किसी भी फैटी एसिड के एक ही प्रयोग abundances भीतर नमूनों के बीच तुलना करें. यदि एक बिल्कुल एक फैटी एसिड quantitate करना चाहता था, एक तरह से यह हासिल करने के लिए एक के रूप में एक stably isotopically लेबल 13 कि या इसी तरह के फैटी एसिड की सी संस्करण के एक ज्ञात मात्रा के साथ बालीदार ऊपर तैयार नमूना चलाने होगा सकता है, इतना है कि यह हो सकता है एमएसडी में माता पिता के उदाहरण के लिए, आयन के बड़े पैमाने पर आधारित प्रतिष्ठित. यह देखते हुए कि हम केवल लागत का कम से कम कर रहे हैं लिपिड वर्गों के रिश्तेदार मात्रा में या किसी भी फैटी एसिड हमारे 13:00 टैग और 17:00 PL मानकों इस उद्देश्य के पर्याप्त रूप से सेवा, की तुलना करने के लिए,प्रत्येक वर्ग के लिपिड पर्याप्त और प्रतिनिधि वसूली का आश्वासन देता हूं.
इस बिंदु तक, वहाँ एक आम सहमति की कमी कुछ परिणामों की व्याख्या विभिन्न के तरीके से प्राप्त करने के लिए, और प्रचलित तरीके में क्या किया जाना चाहिए के रूप में किया गया है. कुल मिलाकर यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अलगाव में कोई एक विधि आदर्श सी. में वसा के चयापचय का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है एलिगेंस. हालांकि, कई जांच और सत्यापन के तौर तरीकों का उपयोग करके, एक लिपिड नियामक जीन पर प्राप्त आंकड़ों में विश्वास प्राप्त कर सकते हैं. इस प्रकार, हम इरादा लिए हमारे प्रोटोकॉल सी. के क्षेत्र में भविष्य के काम के लिए एक बेंचमार्क के रूप में सेवा करने के लिए एलिगेंस वसा अनुसंधान.
The authors have nothing to disclose.
हम चर्चा और पांडुलिपि पढ़ने के लिए माइकल Kacergis तकनीकी सहायता और Lianfeng वू के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. इस काम में एक कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा NIH / NIDDK (K08DK087941 आस), / NIH NIDDK प्रशिक्षण अनुदान (5T32DK007028 ECP), एलिसन मेडिकल फाउंडेशन नई विद्वान एजिंग पुरस्कार (आस) में, और चार्ल्स एच से समर्थित किया गया हूड फाउंडेशन बाल स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार (आस).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |