Primært hvide præadipocytter isoleret fra hvide fedtvæv hos mus kan opdeles i beige / Brite celler. Præsenteret her er en pålidelig trådløs model system til at undersøge den molekylære regulering af "bruning" af hvidt fedt.
Brune adipocyter har evnen til at afkoble den respiratoriske kæde i mitochondrierne og sprede kemiske energi som varme. Udvikling af UCP1-positive brune adipocyter i hvide fedtvæv (såkaldte beige eller Brite celler) er stærkt induceres af en lang række miljømæssige signaler, såsom kronisk kulde eller PPARy-agonister derfor denne celletype har potentiale som et terapeutisk mål for fedme behandling. Selv om de fleste immortaliserede adipocyt linier ikke kan gentage processen med "brunfarvning" af hvidt fedt i kultur, primære adipocytter isoleret fra stromal vaskulær fraktion i subkutant white adipose tissue (WAT) tilvejebringe et pålideligt cellulært system til at undersøge den molekylære kontrol af beige / Brite celleudvikling . Her beskriver vi en protokol for effektiv isolering af primære præadipocytter og til fremkaldelse af differentiering til beige / Brite celler i kultur. Den bruning effekt kan vurderes ved ekspression af brunt fedt-selektiv mærkeERS såsom UCP1.
Fedme er dramatisk stigende på verdensplan, og er nu betragtes som en af de mest alvorlige bekymringer for folkesundheden 1. Denne tilstand er forbundet med en misbalance i energiindtag i forhold til udgifterne og resulterer i overskydende energi lagres som lipid i hvidt adipøst væv (WAT). Forstørret WAT er forbundet med øget masse og vægt, mens brunt fedtvæv har evnen til at sprede overskydende energi til at producere varme. Derfor BAT kan fungere som beskyttelse mod både kulde og fedme 2,3. Dette opnås ved afkobling af elektrontransport i mitokondrierne ved frakobling protein 1 (UCP1). Dette protein betragtes som kendetegnende for nonshivering termogenese i BAT 3. Flere undersøgelser i de senere år har vist, at voksne mennesker har funktionel BAT 4-8 og dermed kan manipulation af BAT i mennesker være en potentiel terapeutisk intervention i kampen mod fedme og dens sygdomme.
jove_content "> Aktuel viden indikerer, at to typer af brune adipocyter findes hos gnavere," klassisk "eller" præ-eksisterende "brunt fedt udvikles under prænatal fase og danner dedikerede brune adipose depoter i interscapular regionen og andre perifere væv På den anden side. En "inducerbar" form af brunt fedt (såkaldte brite eller beige celler) udvikles under postnatale fase og vises indflettet i hvide fedtvæv. De to typer af brune adipocyter er også adskilt af forskellige udviklingsstadier oprindelse. Mens den allerede eksisterende brune adipocyter skyldes myoblastsic-lignende Myf5 forstadier, de inducerbare Brite / beige celler indflettet i WAT opstå fra en ikke-Myf5 linjen 9,10. Derudover er regulatoriske veje af denne celletype kan være forskellig fra den Myf5-afledte brown adipocytter 11. Udviklingen af beige celler (dvs. "brunfarvning" af hvidt fedt) kan aktiveres som reaktion på kronisk kulde ogβ3-adrenoceptor-agonister eller PPARy-agonister hos voksne 12-14. De beige / Brite celler sandsynligvis er en lovende terapeutisk mål for manipulation af samlede energibalance og kan potentielt blive en del af fedme behandling, og derfor er det vigtigt at forstå præcise molekylære mekanismer og signaleringsveje, hvorved miljømæssige signaler styrer udviklingen af beige celler.For at forstå den molekylære kontrol af brunfarvning af hvidt fedt, er in vitro-eksperimenter bedst egnet som differentieringen af præadipocytter foregår temmelig asynkront, og det er vanskeligt at detektere af cellerne in situ 15. Selv om undersøgelser af adipocyt udvikling således er hidtil blevet udført primært på cellelinier, såsom 3T3-L1, 3T3-F442A eller HIB1, disse cellelinjer synes at mangle den molekylære signatur af beige celler. På den anden side, er primære adipocytter isoleret fra subkutan WAT mest sandsynligt, at gentage de forarbejds i brunfarvning af hvidt fedt i en celle selvstændig måde. Her giver vi en protokol for effektiv isolering af det stromale-kar fraktion fra fedtvæv og til at fremkalde den brunfarvning af hvide fedt som reaktion på PPARy-agonister. Rosiglitazon er blevet vist at være et særligt effektivt mediator af brunfarvning i disse celler. Som tidligere antydet 16, kan denne cellulære system anvendes til at tjene et pålideligt cellulært system til at studere udviklingen af beige / Brite celler.
Her præsenterer vi et pålideligt cellulært system til at studere udviklingen af beige / Brite celler i primære dyrkede adipocytter i mus. Sammenlignet med adskillige tilgængelige udødeliggjorte cellelinier, dette system vil sandsynligvis give bedre relevans for brunfarvning af hvidt fedt in vivo.
Selv om studiet af disse primære adipocytter giver nogle fordele, der også findes visse begrænsninger og bekymringer, der er vigtige at overveje. Dels dette system er meget a…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, og Lauren Ruiz for diskussion, teknisk hjælp og redaktionel bistand på manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (DK087853) fra Program for Breakthrough Biomedical Research og fra Asubio Pharm Inc. til SKULA blev støttet af en aktie ph.d.-stipendier fra Københavns Universitet og EU FP7 projekt Diabat (HEALTH-F2 -2.011-278.373) til Lise Madsen og Karsten Kristiansen. Vi anerkender også den DERC center tilskud (NIH P30 DK063720).
Reagent | |||
Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
Dispase II | Roche | 04942078001 | |
CaCl2 | |||
DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
Insulin | |||
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
IBMX | Sigma | I-5879 | |
Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
Equipment | |||
Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |