Summary

Выделение и дифференциация стромальные клетки сосудов в бежевый / Brite клетки

Published: March 28, 2013
doi:

Summary

Первичные белые преадипоциты изолированы от белого жировой ткани у мышей, могут быть дифференцированы в бежевый / Brite клеток. Представленные здесь является надежной системы сотовой модель для изучения молекулярных регулировании "Браунинг" белый жир.

Abstract

Браун адипоциты имеют возможность отделить дыхательной цепи митохондрий и рассеивать химическую энергию в виде тепла. Развитие UCP1-положительных коричневый адипоцитов в белой жировой ткани (так называемый бежевый или Brite клеток) очень индуцированных различными сигналами окружающей среды, таких как хроническая холода или PPAR-агонистов, поэтому этот тип клеток имеет потенциал в качестве терапевтической мишени для лечения ожирения. Хотя большинство увековечили линий адипоцитов не может повторять процесс "Браунинг" белый жир в области культуры, основной адипоцитов изолированы от стромальных сосудистой фракции в подкожной жировой ткани белого (WAT) обеспечивают надежное сотовой системы для изучения молекулярного контроля бежевый / Brite развития клеток . Здесь мы опишем протокол для эффективной изоляции первичной преадипоциты и для индукции дифференцировки бежевый / Brite клеток в культуре. Эффект потемнения может быть оценена по выражению бурого жира-селективные маркиERS, таких как UCP1.

Introduction

Ожирение является резко возрастает во всем мире и в настоящее время считается одной из наиболее серьезных проблем общественного здравоохранения 1. Это условие связано с дисбалансом энергии относительного потребления в расходах и в результате избыточная энергия хранится в виде липидов в белой жировой ткани (WAT). Расширенное WAT связана с повышенной массой тела и вес, а бурой жировой ткани обладает способностью рассеивать избыток энергии для производства тепла. Поэтому BAT может функционировать в качестве защиты от холодного и ожирением 2,3. Это достигается путем разобщения транспорта электронов в митохондриях на разобщение белков 1 (UCP1). Этот белок считается признаком для nonshivering термогенеза в BAT 3. Некоторые исследования последних лет показали, что взрослые люди имеют функциональные BAT 4-8 и, следовательно, манипуляции BAT у людей может быть потенциальным терапевтическим вмешательством в борьбе против ожирения и связанных с ним заболеваний.

jove_content "> Текущие данные показывают, что два вида бурых адипоцитов существуют у грызунов;« классических »или« уже существующих "коричневый жир развивается во внутриутробном этапе и образует посвященный коричневые жировые депо в межлопаточной области и других периферических тканях с другой стороны. , "индуцибельной" формы бурого жира (так называемый Brite или бежевый клеток) развивается в течение послеродового сцене и появляется перемежаются в белой жировой ткани. двух видов бурых адипоцитов также разделяются по разным развитием происхождение. то время как ранее существовавшие коричневый адипоцитов возникают из myoblastsic типа Myf5 прекурсоров, индуцируемый Brite / бежевый клетки перемежаются в WAT возникают из не-Myf5 линии 9,10. Кроме того, регуляторные пути этого типа клеток, вероятно, будет отличаться от Myf5 полученных коричневый адипоциты 11. развития бежевый клеток (например, "Браунинг" белый жир) может быть активирован в ответ на хроническое воздействие холодного иβ3-адренорецепторов-агонисты или агонисты PPAR-гамма у взрослых 12-14. Бежевый / Brite клеток, вероятно, будут перспективные терапевтические мишени для манипуляции общий энергетический баланс и потенциально может стать частью лечения ожирения и, следовательно, важно понять точные молекулярные механизмы и сигнальные пути, с помощью которых сигналами окружающей среды контролируют развитие бежевый клеток.

Чтобы понять молекулярный контроль поджаривания белого жира, в пробирке эксперименты лучше всего подходит в качестве дифференциации преадипоциты проходит довольно асинхронно, и трудно обнаружить клетки на месте 15. Хотя исследования по развитию адипоцитов до сих пор были выполнены в основном на клеточных линиях, таких как 3T3-L1, 3T3-F442A или HIB1, эти клеточные линии, по всей видимости, имеют молекулярную подпись бежевый клеток. С другой стороны, первичные адипоцитов изолированы от подкожного WAT, скорее всего, повторять процессорыс подрумянивания жира белого в камере автономно. Здесь мы предлагаем протокола для эффективной изоляции стромальных-сосудистой фракции из жировой ткани и вызывая потемнение жира белых в ответ на PPAR-агонистов. Розиглитазона было показано, что особенно эффективным посредником потемнения в этих клетках. Как ранее предложил 16, эта система сотовой связи может использоваться, чтобы служить надежной системы сотовой связи для изучения развития бежевый / Brite клеток.

Protocol

1. Подготовка пищеварения Средний Сделайте 5 мл на 5 мышей на ткани (примерно 1 мл / 1 г жировой ткани). Взвешивание в пищеварении ферменты: – Collaginase D: 1,5 Ед / мл (1108874103, 1 г, Roche, 70334223) – Диспазы II: 2,4 Ед / мл (04942078001, 0980 мг / Лио, Roche, 11466200) Добавить 25 мл PBS и хорошо переме…

Representative Results

Браунинг первичных адипоцитов можно получить, измерив экспрессию мРНК UCP1 и других бурого жира или конкретной селективной генов QRT-PCR. Представленные на рисунке 1 данных генной экспрессии в паховой WAT-производных первичных адипоцитов. Клетки индуцировать дифференцировку ?…

Discussion

Здесь мы представляем надежные системы сотовой связи для изучения развития бежевый / Brite клеток в первичной культуре адипоцитов у мышей. По сравнению с несколькими доступными увековечили клеточных линий, эта система, вероятно, обладают повышенной отношение к потемнению белый жир в е…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Харуя Оно, Kosaku Шинода, Louis Sharp, Эми Tomoda, и Лорен Ruiz для обсуждения, техническую помощь и помощь в редактировании по рукописи. Эта работа была поддержана грантами NIH (DK087853), с Программой Прорыв биомедицинских исследований и от Asubio Фарм Инк Скула была поддержана доля стипендии PhD из Университета Копенгагена и ЕС FP7 проекта Diabat (ЗДОРОВЬЕ-F2 -2011-278373), чтобы Лиза Мэдсен и Карстен Кристиансен. Мы также признаем, DERC центр гранта (NIH P30 DK063720).

Materials

Reagent
Collaginase D Roche 11088874103
Dispase II Roche 04942078001
CaCl2
DMEM medium Fisher 10017-CV With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate
Insulin
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) Sigma T-2877
Indomethacin Sigma I-7378
Dexamethasone Sigma D-1756
IBMX Sigma I-5879
Rosiglitazone Sigma R-2408
Equipment
Collagen coated dishes BD 354450 10 cm plates
70 μm filter BD Falcon 352350 Cell strainer,70 μm nylon 1/ea

References

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

Play Video

Cite This Article
Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J. Vis. Exp. (73), e50191, doi:10.3791/50191 (2013).

View Video