Выделение и дифференциация стромальные клетки сосудов в бежевый / Brite клетки
Summary
Первичные белые преадипоциты изолированы от белого жировой ткани у мышей, могут быть дифференцированы в бежевый / Brite клеток. Представленные здесь является надежной системы сотовой модель для изучения молекулярных регулировании "Браунинг" белый жир.
Abstract
Браун адипоциты имеют возможность отделить дыхательной цепи митохондрий и рассеивать химическую энергию в виде тепла. Развитие UCP1-положительных коричневый адипоцитов в белой жировой ткани (так называемый бежевый или Brite клеток) очень индуцированных различными сигналами окружающей среды, таких как хроническая холода или PPAR-агонистов, поэтому этот тип клеток имеет потенциал в качестве терапевтической мишени для лечения ожирения. Хотя большинство увековечили линий адипоцитов не может повторять процесс "Браунинг" белый жир в области культуры, основной адипоцитов изолированы от стромальных сосудистой фракции в подкожной жировой ткани белого (WAT) обеспечивают надежное сотовой системы для изучения молекулярного контроля бежевый / Brite развития клеток . Здесь мы опишем протокол для эффективной изоляции первичной преадипоциты и для индукции дифференцировки бежевый / Brite клеток в культуре. Эффект потемнения может быть оценена по выражению бурого жира-селективные маркиERS, таких как UCP1.
Introduction
Ожирение является резко возрастает во всем мире и в настоящее время считается одной из наиболее серьезных проблем общественного здравоохранения 1. Это условие связано с дисбалансом энергии относительного потребления в расходах и в результате избыточная энергия хранится в виде липидов в белой жировой ткани (WAT). Расширенное WAT связана с повышенной массой тела и вес, а бурой жировой ткани обладает способностью рассеивать избыток энергии для производства тепла. Поэтому BAT может функционировать в качестве защиты от холодного и ожирением 2,3. Это достигается путем разобщения транспорта электронов в митохондриях на разобщение белков 1 (UCP1). Этот белок считается признаком для nonshivering термогенеза в BAT 3. Некоторые исследования последних лет показали, что взрослые люди имеют функциональные BAT 4-8 и, следовательно, манипуляции BAT у людей может быть потенциальным терапевтическим вмешательством в борьбе против ожирения и связанных с ним заболеваний.
jove_content "> Текущие данные показывают, что два вида бурых адипоцитов существуют у грызунов;« классических »или« уже существующих "коричневый жир развивается во внутриутробном этапе и образует посвященный коричневые жировые депо в межлопаточной области и других периферических тканях с другой стороны. , "индуцибельной" формы бурого жира (так называемый Brite или бежевый клеток) развивается в течение послеродового сцене и появляется перемежаются в белой жировой ткани. двух видов бурых адипоцитов также разделяются по разным развитием происхождение. то время как ранее существовавшие коричневый адипоцитов возникают из myoblastsic типа Myf5 прекурсоров, индуцируемый Brite / бежевый клетки перемежаются в WAT возникают из не-Myf5 линии 9,10. Кроме того, регуляторные пути этого типа клеток, вероятно, будет отличаться от Myf5 полученных коричневый адипоциты 11. развития бежевый клеток (например, "Браунинг" белый жир) может быть активирован в ответ на хроническое воздействие холодного иβ3-адренорецепторов-агонисты или агонисты PPAR-гамма у взрослых 12-14. Бежевый / Brite клеток, вероятно, будут перспективные терапевтические мишени для манипуляции общий энергетический баланс и потенциально может стать частью лечения ожирения и, следовательно, важно понять точные молекулярные механизмы и сигнальные пути, с помощью которых сигналами окружающей среды контролируют развитие бежевый клеток.Чтобы понять молекулярный контроль поджаривания белого жира, в пробирке эксперименты лучше всего подходит в качестве дифференциации преадипоциты проходит довольно асинхронно, и трудно обнаружить клетки на месте 15. Хотя исследования по развитию адипоцитов до сих пор были выполнены в основном на клеточных линиях, таких как 3T3-L1, 3T3-F442A или HIB1, эти клеточные линии, по всей видимости, имеют молекулярную подпись бежевый клеток. С другой стороны, первичные адипоцитов изолированы от подкожного WAT, скорее всего, повторять процессорыс подрумянивания жира белого в камере автономно. Здесь мы предлагаем протокола для эффективной изоляции стромальных-сосудистой фракции из жировой ткани и вызывая потемнение жира белых в ответ на PPAR-агонистов. Розиглитазона было показано, что особенно эффективным посредником потемнения в этих клетках. Как ранее предложил 16, эта система сотовой связи может использоваться, чтобы служить надежной системы сотовой связи для изучения развития бежевый / Brite клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем надежные системы сотовой связи для изучения развития бежевый / Brite клеток в первичной культуре адипоцитов у мышей. По сравнению с несколькими доступными увековечили клеточных линий, эта система, вероятно, обладают повышенной отношение к потемнению белый жир в е…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Харуя Оно, Kosaku Шинода, Louis Sharp, Эми Tomoda, и Лорен Ruiz для обсуждения, техническую помощь и помощь в редактировании по рукописи. Эта работа была поддержана грантами NIH (DK087853), с Программой Прорыв биомедицинских исследований и от Asubio Фарм Инк Скула была поддержана доля стипендии PhD из Университета Копенгагена и ЕС FP7 проекта Diabat (ЗДОРОВЬЕ-F2 -2011-278373), чтобы Лиза Мэдсен и Карстен Кристиансен. Мы также признаем, DERC центр гранта (NIH P30 DK063720).
Materials
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
- Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
- Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
- Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
- Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
- Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
- Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
- Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
- Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
- Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
- Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
- Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
- Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
- Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
- Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
- Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
- Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).
