En este artículo se describe la preparación de tejido de melanoma recién obtenido en cultivos de células primarias, y cómo eliminar contaminaciones de los eritrocitos y los fibroblastos de las células tumorales. Por último, se describe cómo CD133<sup> +</sup> Supuestas células madre de melanoma se ordenan desde el CD133<sup> -</sup> Granel usando magnética Clasificación de células activadas (MACS).
A pesar de las opciones de mejora de los tratamientos para el melanoma disponibles en la actualidad, los pacientes con melanoma maligno avanzado todavía tienen un mal pronóstico para la supervivencia libre de progresión y global. Por lo tanto, la investigación traslacional tiene que proporcionar más pruebas moleculares para mejorar las terapias dirigidas para los melanomas malignos. En los últimos mecanismos oncogénicos, relacionados con el melanoma se estudiaron extensamente en líneas celulares establecidas. En el camino a los regímenes de tratamiento más personalizadas basadas en perfiles genéticos individuales, nos proponemos utilizar paciente derivados de las líneas celulares en lugar de líneas celulares genéricos. Junto con los datos clínicos de alta calidad, especialmente en el seguimiento del paciente, estas células serán fundamentales para comprender mejor los mecanismos moleculares de la progresión del melanoma.
Aquí reportamos el establecimiento de cultivos de melanoma primario de tejido tumoral fresco disecado. Este procedimiento incluye la disociación de picar carne y el tejido en células individuales, reremoción de contaminación con eritrocitos y fibroblastos, así como cultivo primario y verificación fiable del origen de las células de melanoma.
Informes recientes revelan que los melanomas, como la mayoría de los tumores, puerto una pequeña subpoblación de células madre de cáncer (CSC), que parecen alimentar exclusivamente la iniciación del tumor y la progresión hacia el estado metastático. Uno de los marcadores principales de la identificación y el aislamiento CSC en el melanoma es CD133. Para aislar CD133 + células madre cancerosas a partir de cultivos primarios de melanoma, se ha modificado y optimizado la clasificación de células activada por Magnetic (MACS) procedimiento de Miltenyi resultante en clasificación de alta pureza y viabilidad de las células madre cancerosas CD133 + y CD133 – a granel, que pueden ser cultivadas y analizadas funcionalmente a partir de entonces.
Melanomas malignos cutáneos son el tipo menos común, pero más mortal de cáncer de piel. Debido a una incidencia cada vez mayor, de alto grado de malignidad y una rápida difusión, los melanomas representan actualmente el 75% de los tumores malignos de la piel relacionados con 1,2 muertes. Además de la extirpación quirúrgica del tumor primario, quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y combinada de quimioterapia e inmunoterapia del melanoma metastatizado son las estrategias de estado-de-la-arte para el tratamiento de melanoma 3,4. Sin embargo, el melanoma maligno se caracteriza por una mala respuesta a la quimioterapia (5-12%) 5,6, y sólo los que 50-70% de los pacientes con melanoma llevan el gen BRAF V600E beneficio mutación de nuevas y prometedoras terapias específicas como el tratamiento con vemurafenib 7 Para mejorar la supervivencia global, una mejor comprensión de los mecanismos de tumorigénesis melanoma es necesaria.
Para el estudio de estos mecanismos en el pasado, bien establecida comercialmentelíneas celulares cialmente disponibles fueron utilizados. Los enfoques más recientes para el estudio de los eventos moleculares de la iniciación y progresión del cáncer utilizan cultivos primarios derivados directamente del tejido tumoral – a los beneficios de soporte estrategia múltiple: El investigador tiene el control completo del paciente y la selección de los tejidos. Las células de la muestra obtenida a partir de tejido tumoral experta seleccionado, se asemejan al tumor con toda su heterogeneidad y los datos de seguimiento del paciente y de una patología detallado está disponible para permitir las características de la cultura de ser comparados con los del tumor original 8.
En contraste, el uso de líneas celulares establecidas, como sistemas modelo en la investigación del cáncer se han despertado controversia. Ya en 1987 Osborne et al describieron importantes diferencias biológicas entre MCF-7 líneas celulares de cáncer de mama humanos de diferentes laboratorios 9. Esta inestabilidad genómica y extensa variación en la expresión del ARN durante subcultivo fue confirmed por Hiorns et al. y proporcionaron datos de apoyo para las pruebas de que las líneas celulares evolucionan en la cultura, lo que debilita la importancia directa de dichas culturas establecidas como modelos de cáncer humano 10.
Otra consideración importante, que ha sido en gran parte ignorado en los últimos años, es el riesgo de contaminación o crecimiento excesivo de las culturas no relacionadas con "falsas" las células, que se destacó primero hace más de veinte años atrás, demostrando que un gran número de líneas de células HeLa fueron contaminados por células 8,11. La mala interpretación de los datos de las líneas celulares 'false' ha salido a la luz recientemente en la literatura de nuevo. Usando una combinación de análisis de ADN y citogenética molecular, MacLeod et al. Reveló que 252 de los nuevos derivados del tumor líneas celulares humanas depositados en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), casi el 18% se encontró que dentro de una especie o entre especies cruz -contaminantes 12,13.
Para evitar estos problemas y para hacer uso de las ventajas mencionadas anteriormente, se decidió establecer bajo pasaje líneas celulares de melanoma de metástasis recién extirpadas.
Robustos celulares tecnologías de separación y análisis requieren una sola célula de preparaciones que se genere limitando al mismo tiempo la muerte celular y la destrucción de las proteínas de superficie característicos. Un instrumento de mesa para la disociación automatizado de tejidos en una sola célula de suspensiones es el disociador gentleMACS fabricado por Miltenyi. Cuando se utiliza en combinación con gentleMACS C Tubos y soluciones optimizado disociación, una disociación eficaz y suave de tejido tumoral en un sistema cerrado se logra conservando epítopos antigénicos y la reducción de la pérdida de células. El instrumento ofrece optimizados, programas preestablecidos para una variedad de aplicaciones específicas y las garantías de preparación estandarizada de solo suspensiones de células de tejido de melanoma 14.
<p class = "jove_content"> Informes recientes revelaron que la mayoría de los tumores albergar una pequeña subpoblación de las llamadas células madre cancerosas (CSC), que presentan exclusivamente iniciadoras del tumor y la capacidad de auto-renovación. La identificación de las células madre de melanocitos que producen en la dermis de la piel llevado a la hipótesis de que estas células podría ser el origen de las células madre cancerosas (CSC) en melanoma ya que la exposición a la radiación UVA puede cebar estas células para la transformación maligna 15. El resultado de tal lesión genética sería células que albergan una combinación de tumor y las características de células madre.Uno de los indicadores clave propuestos para representar a la subpoblación de células madre cancerosas en el melanoma es CD133 16-20. CD133 (también conocido como Prominin 1), un miembro de glicoproteínas transmembrana pentaspan, se expresa en las células madre hematopoyéticas, células progenitoras endoteliales, células madre neuronales y gliales 21-23. La expresión de CD133 se correlaciona conla división celular asimétrica 24, y el epítopo glicosilado de CD133 mostró ser downregulated a la diferenciación celular 25. Recientemente, CD133 + células de melanoma se han mostrado a la auto-renovación y la iniciación del tumor capacidad 19,20.
Para estudiar la función de CD133 + putativo melanoma CSC, se ha modificado y optimizado la clasificación celular activado magnético (MACS) Sistema de Miltenyi Biotech para obtener poblaciones altamente enriquecido y viables de CD133 + y CD133 – células.
Magnética basado en perlas separación celular permite a una selección negativa, como se muestra por Matheu et al. 26 o selección positiva como se muestra aquí. Durante la selección positiva del tipo de célula diana particular, por ejemplo, las células que expresan CD133, está magnéticamente etiquetados con microperlas, partículas superparamagnéticas 50-nm que están conjugados con anticuerpos altamente específicos contra unantígeno de superficie celular particular. Durante la separación, las células marcadas magnéticamente quedan retenidas dentro de la columna en el campo magnético del separador, mientras que las células no marcadas fluya a través. Después de etapas de lavado, la columna se retira del campo magnético del separador, y las células diana se eluyó de la columna. El LS o columnas MS utilizado durante resultado de la selección positiva en fracciones de células marcadas y no marcadas con alta pureza. Por otra parte, las columnas de LD, que se utilizan para la selección negativa, dan como resultado una pureza ligeramente inferior de la fracción de marcado. Debido a la más denso de su matriz de la velocidad de flujo en estas columnas es menor que resulta en un riesgo más alto de células no marcadas para ser atrapadas en la columna. Columnas LD por lo tanto debe ser utilizado sólo por el agotamiento estricto de una subpoblación de células no deseadas. La selección positiva se puede realizar por medio del etiquetado magnético directo (anticuerpo acoplado a MicroBeads) o indirecta (incubación con MicroBeads tras la incubation con el anticuerpo primario). MicroBeads MACS específicos están disponibles para la selección positiva de numerosos tipos de células de las células tumorales primarias como la próstata o melanoma 27.
Con el fin de eliminar contaminaciones de eritrocitos de la célula tumoral pellet es muy recomendable el uso de la célula de sangre roja solución de lisis de Miltenyi. Las ventajas de la lisis de los eritrocitos durante la centrifugación en gradiente de Ficoll densidad tradicional son que es más rápido y sencillo. Además, contaminaciones con Ficoll o células rojas de la sangre y la pérdida de las células tumorales se evitan. Cuando se observa el crecimiento de los fibroblastos en el cultivo de células primari…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen al Prof. M. Dietel y Dirk Schumacher por apoyar este trabajo y la lectura crítica del manuscrito.
La investigación que lleva a estos resultados ha recibido el apoyo de la Empresa Común de la Iniciativa sobre medicamentos innovadores bajo acuerdo de subvención n ° 115234, recursos de los cuales están compuestos por la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y las empresas EFPIA »en clase contribución. Este trabajo fue apoyado también por el Krebsgesellschaft Berliner (BKG).
Reagent | |||
Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
Equipment | |||
Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |